小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因敲除载体的构建

目的 :构建用于小鼠牙本质涎磷蛋白基因敲除的载体 ;方法 :PCR获得上、下游两条同源臂 ,将同源臂和正、负双向筛选标志按一定顺序克隆到载体 pBluescript中 ,序列测定确认正确后 ,NotI酶切使载体线性化 ;结果 :载体中各部分的排列顺序与预期一致 ;结论 :获得了小鼠牙本质涎磷蛋白基因敲除的载体 ,为以后的工作打下了基础。

小鼠牙胚、软骨组织中牙本质涎磷蛋白基因的克隆

目的 :从小鼠牙胚、软骨组织中克隆牙本质涎磷蛋白基因 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)。方法 :采用RT -PCR方法 ,从小鼠牙胚及软骨组织中克隆DSPP基因片段 ,将所得片段装入载体pGEM -TEasyVector进行序列测定。结果 :从两种组织中均获得 719bp的特异性片段。序列分析表明 ,与已发表的DSPP序列99.7%同源。结论 :成功地从小鼠牙胚、软骨中克隆到DSPP基因部分序列。结果提示 :除牙齿组织外 ,DSPP还可在软骨中表达 。

DSPP基因启动子不同片段启动活性的对比分析

目的:对比分析牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)基因启动子不同片段的启动活性。方法:选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察DSPP基因启动子不同片段的启动活性。结果:在MDPC-23细胞中,DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体均不同程度地表现了启动活性,其启动活性有差异(P<0.01)。结论:DSPP基因启动子不同片段的启动活性有差异,其活性变化反映位于-95bp～54bp、-410bp～-195bp、-1243bp～-791bp、-1447bp～-1243bp、-3519bp～-2475bp区存在潜在的增强子;-195bp～-95bp、-670bp～-410bp、-2475bp～-1447bp区存在潜在的抑制子。进一步明确了DSPP基因启动子的结构,为今后研究DSPP基因的特异性表达奠定基础。

小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)特异性启动子的克隆和序列分析

目的 :获得小鼠牙本质涎磷蛋白 (DSPP)编码序列上游约 1.6kb的特异性启动子。方法 :按Mac Dougall报道设计一对引物 ,提取小鼠胚胎干细胞基因组DNA作为模板 ,PCR获得大小约为 1.6kb的DNA片段 ,将该片段克隆并进行序列分析。结果 :所得到的片段是DSPP的特异性启动子 ,其序列与文献报道有一定差异 ,但转录因子的结合位点均未发生突变。结论 :成功获得小鼠DSPP的特异性启动子 ,为进一步的研究打下基础。

人牙本质涎磷蛋白启动子驱动LacZ报告基因在人牙胚间充质细胞中表达

牙本质涎磷蛋白(DSPP)的表达是细胞向成牙本质细胞分化的标志。试图分析人DSPP启动子及构建人DSPP启动子驱动的Lac Z基因表达的报告体系,从而方便快捷检测细胞是否向成牙本质细胞分化。为了建立能表达DSPP的细胞体系,分离了人牙胚间充质细胞,并用地塞米松诱导培养液进行诱导,结果显示,该诱导培养液能有效地诱导人牙胚间充质细胞DSPP基因的表达。利用双荧光素酶报告系统对4段人DSPP基因5′上游区域(-4 000-+54、-2 500-+54、-1 447-+54和-1 027-+54)进行分析,结果显示-2 500-+54区域的启动子活性最高。5′上游区从?2 500 bp延长到?4 000 bp时,启动子活性下降;5′上游区从-2 500 bp缩短至-1 447 bp时,启动子活性下降;再次将-1 447 bp缩短至-1 027 bp时,启动子活性进一步下降。结果暗示在-4 000 bp至-2 500 bp区域存在转录抑制元件,-2 500 bp至-1 027 bp区域存在转录激活元件。用-2 500-+54启动子区域和Lac Z基因构建ph DSPP-Lac Z慢病毒报告载体,并分别在人牙胚间充质细胞和永生化人牙胚间充质细胞系ih EDMC4上检测ph DSPP-Lac Z报告载体的功能,通过X-Gal染色,结果显示在2种细胞牙向分化过程中均可检测到Lac Z基因的表达。研究构建的ph DSPP-Lac Z慢病毒报告载体可为诱导人源细胞牙向分化、牙齿发育、牙齿再生工程等研究中DSPP的表达检测提供一种更加便捷的手段。