IgG受体FcγRⅡB调节实验性自身免疫性脑脊髓炎致神经元损伤及Th17/Treg免疫平衡的作用研究

目的:探究IgG受体FcγRⅡB对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型小鼠神经元损伤与Th17/Treg失衡的作用。方法:C57BL/6小鼠随机分组为对照组、EAE组、FcγRⅡB组、EAE+FcγRⅡB组,每组15只,皮下注射MOG35-55肽诱导EAE模型,并给予FcγRⅡB慢病毒液处理;造模后每日称量小鼠体质量,进行神经功能评分,持续30 d;30 d后处死小鼠,HE染色观察脑组织病理形态学变化,LFB染色评估脊髓髓鞘结构变化,免疫荧光染色检测脊髓大脑皮质神经元核抗原(NeuN)和Caspase-3表达,TUNEL染色检测神经元细胞凋亡,ELISA检测血清IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β水平,流式细胞术分析脾脏Th17、Treg细胞比例分布,Western blot测定脊髓组织维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)与Forkhead家族转录因子3(Foxp3)蛋白表达。结果:与对照组比较,EAE组小鼠体质量下降,神经功能评分升高,脑组织内炎症细胞浸润明显,脊髓中出现脱髓鞘迹象,NeuN荧光表达强度减弱而Caspase-3荧光表达强度增强,TUNEL阳性着色细胞多,细胞凋亡数增加,血清中IL-6和IL-17水平升高,IL-10和TGF-β水平降低,脾脏内Th17细胞比例升高,Treg比例降低,脊髓组织内RORγt蛋白表达上调,Foxp3蛋白表达下调(P<0.05);与EAE组比较,EAE+FcγRⅡB组小鼠体质量增加,神经功能评分降低,脑组织内炎症细胞浸润减轻,脊髓脱髓鞘现象得到改善,NeuN荧光表达强度增强,Caspase-3荧光表达强度减弱,TUNEL阳性着色细胞较少,细胞凋亡数减少,血清中IL-6和IL-17水平降低,而IL-10和TGF-β水平升高,同时脾脏内Th17细胞比例降低,Treg比例升高,脊髓组织内RORγt蛋白表达下调而Foxp3蛋白表达上调(P<0.05)。结论:FcγRⅡB对EAE小鼠具有神经保护作用,可减轻其脑组织炎症细胞浸润及脱髓鞘现象,作用机制可能与调节细胞因子水平及Th17/Treg细胞免疫平衡有关。

参芪蛭龙汤对膜性肾病模型小鼠肾组织中FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅢA表达的影响

目的 探讨参芪蛭龙汤对膜性肾病(MN)模型小鼠肾组织中FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅢA表达的影响。方法 60只SPF级ICR小鼠,6周龄,体重(23±4)g,雌雄各半,按照随机数字表法分为空白组(10只)和造模组(50只)。造模组小鼠注射阳离子化牛血清白蛋白,复制MN小鼠模型。取其中造模成功的40只小鼠按照随机数字表法分为模型组,参芪蛭龙汤高、低剂量组(24、12 g/kg)和雷公藤多苷片组(14 mg/kg),每组10只。给药4周后,处死小鼠。HE、Masson染色观察肾脏组织病理变化;免疫荧光法观察肾组织中FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅢA蛋白荧光强度;Western blot检测肾脏组织内FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅢA蛋白表达;RT-PCR检测肾脏组织中FcγRⅠ、FcγRⅡB、FcγRⅢA mRNA表达。结果 HE染色显示空白组小鼠上皮细胞、基底膜、肾小管及肾间质形态结构均未见明显异常。模型组小鼠肾小球体积增大,肾小球毛细血管袢扩张,血细胞溢出,肾小球系膜增厚,肾小囊腔增大,局部肾小囊腔壁上皮严重破损。与模型组比较,参芪蛭龙汤高剂量组小鼠可见肾小球体积减小,基底膜增厚减轻,肾小囊壁上皮未破损或局部破损。Masson染色显示空白组小鼠肾小球基底膜正常。模型组小鼠上皮下大量嗜复红蛋白沉积,可见基底膜基质反应,肾小管空泡样脂肪变性,肾间质淋巴大量增生。与模型组比较,各给药组小鼠病变减轻,以参芪蛭龙汤高剂量组改善更加明显。与空白组比较,模型组FcγRⅠ、FcγRⅢA蛋白荧光增强,FcγRⅡB蛋白荧光减弱(P<0.05);与模型组比较,参芪蛭龙汤高剂量组FcγRⅠ、FcγRⅢA蛋白荧光减弱(P<0.05),参芪蛭龙汤高、低剂量组FcγRⅡB蛋白荧光增强(P<0.05);与参芪蛭龙汤低剂量组比较,参芪蛭龙汤高剂量组FcγRⅠ、FcγRⅢA蛋白荧光减弱,FcγRⅡB蛋白荧光增强(P<0.05)。与空白组比较,模型组FcγRⅠ、FcγRⅢA蛋白表达升高,FcγRⅡB蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,参芪蛭龙汤高剂量组FcγRⅠ、FcγRⅢA蛋白表达降低,参芪蛭龙汤高、低剂量组FcγRⅡB蛋白表达升高(P<0.05);与参芪蛭龙汤低剂量组比较,参芪蛭龙汤高剂量组FcγRⅡB蛋白表达升高,FcγRⅢA蛋白表达降低(P<0.05)。与空白组比较,模型组FcγRⅠ、FcγRⅢA mRNA表达升高,FcγRⅡB mRNA表达降低(P<0.05);与模型组比较,参芪蛭龙汤高、低剂量组FcγRⅠ、FcγRⅢAmRNA表达降低,FcγRⅡB mRNA表达升高(P<0.05);与参芪蛭龙汤低剂量组比较,参芪蛭龙汤高剂量组FcγRⅠ、FcγRⅢA mRNA表达降低,FcγRⅡB mRNA表达升高(P<0.05)。结论 参芪蛭龙汤对MN小鼠的治疗作用与改善肾组织病理改变,减少FcγRⅠ、FcγRⅢA蛋白的表达,增加FcγRⅡB蛋白表达有关,其中高浓度的参芪蛭龙汤效果更好。

猪Fc_γRⅡb亚型(Fc_γRⅡb1)基因的分子克隆及鉴定

IgG Fc受体(FcγRs)的一个主要效应机制是可结合IgG免疫复合物发生反应。目前已鉴定出的FcγRs有4类:高亲和力的FcγRⅠ(CD64),中等亲和力的FcγRⅠ、FcγRⅡ(CD32),以及低亲和力的FcγRⅢ(CD16)。人FcγRⅡ主要有FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅡc 3个亚型;小鼠有1个亚型FcγRⅡb;牛有2个亚型FcγRⅡb、FcγRⅡc。人、小鼠、牛中FcγRⅡb又包括2个亚型:FcγRⅡb1(b1)和FcγRⅡb2(b2),但有关猪FcγRⅡb亚型的研究鲜有报道。本研究对猪FcγRⅡb亚型(FcγRⅡb1)进行了分子克隆、测序及鉴定,并运用RT-PCR从猪外周血白细胞RNA中扩增出猪FcγRⅡb1cDNA序列。结果发现,猪FcγRⅡb1cDNA序列包含一个951bp的开放阅读框(ORF),可编码316个氨基酸跨膜糖蛋白,包括两个免疫球蛋白(Ig)样胞外结构域,一个跨膜区域,一个带有免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的胞质尾区。猪FcγRⅡb1cDNA序列与DQ026064同源性为98.3%,其在胞质尾区有一19个氨基酸的插入框。荧光免疫试验结果发现,猪FcγRⅡb1cDNA序列编码的糖蛋白可稳定转染COS-7细胞,结合并激活IgG免疫复合物。猪FcγRⅡb1序列的鉴定为进一步了解猪免疫反应中IgG-FcγR相互作用的分子基础提供参考。

FcγRⅡB_1介导的信号传导异常与SLE患者B细胞的过度活化

目的:观察系统性红斑狼疮(SLE)患者B细胞表面功能分子表达的特征及其功能状态,评价以FcγRⅡB1(CD32)为代表的B细胞自身抑制调节机制在SLE发病中的作用。方法:采用Ficoll密度梯度离心法分离出人外周血单个核细胞(PBMC),并以免疫磁珠法(MACS)分离纯化B细胞。采用荧光分光光度法检测B细胞受不同激活物刺激后细胞内钙([Ca2+]i)的反应。用ELISA法检测B细胞与刺激物共同培养后所分泌IgG的量。采用流式细胞术及间接免疫荧光染色法,检测B细胞膜表面CD32、CD19及IgM的表达水平。结果:(1)以羊抗人μ链的F(ab′)2片段及完整IgG分别刺激SLE患者B细胞时,其[Ca2+]i反应的比值显著低于类风湿性关节炎(RA)患者(P<0.05)及正常人对照(P<0.01)。(2)分别用葡萄球菌A蛋白(SPA)单独刺激与SPA和羊抗人μ链的完整IgG抗体共同刺激SLE患者的B细胞所分泌的IgG的比值,明显低于RA患者及正常人对照组(P<0.05)。(3)SLE患者与RA患者及正常对照组B细胞上CD19、CD32及IgM的表达无统计学意义(P>0.05)。结论:SLE患者B细胞上CD32抑制性信号传导的异常,可能是导致B细胞过度活化的重要机制。

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞FcγRⅡb和血清sCD30水平变化与Th1/Th2细胞漂移关系的研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞(PBMC)FcγRⅡb、CD30的表达与辅助T细胞亚型(Th1/Th2)漂移在SLE发病机制中的作用。方法检测了129例SLE患者和30名健康对照者PBMCFcγRⅡb、Th1、Th2细胞以及血清sCD30;FcγRⅡb的检测采用流式细胞术,血清sCD30的检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA),Th1、Th2细胞的检测采用免疫组化染色方法。结果SLE患者与健康对照者相比,PBMC FcγRⅡb的表达以及Th1细胞明显降低(P<0.01),而血清sCD30水平以及Th2细胞显著升高(P<0.01)。结论PBMC FcγRⅡb、CD30表达的变化以及Th1/Th2细胞漂移与SLE发病机制有关。

FcγRⅡB与系统性红斑狼疮

FcγRⅡB是相对分子质量为40 000的IgG低亲和力受体,FcγRⅡB的胞浆区含有以酪氨酸为基础的抑制小体ITIM(Immunoreceptor Tyrosinesed Inhibition Motif),有抑制淋巴细胞活化的作用。FcγRⅡB表达下降时产生免疫复合物的清除功能障碍,FcγRⅡB表达缺陷是系统性红斑狼疮(SLE)的重要易感因素。

转染FcγRⅡb1基因纠正SLE患者B细胞的过度活化

目的观察转染FcγRⅡb1基因能否纠正SLE患者B细胞的过度活化。方法构建人FcγRⅡb1基因真核载体,通过电穿孔转染SLE患者B细胞。分别采用抗人μ链的F(ab’)2片段[F(ab’)2anti-μ]和抗人μ链的完整IgG(IgG anti-μ)2种抗体刺激B细胞,同时以正常人B细胞作对照。采用分光光度计检测激活B细胞胞内[Ca2+]i反应,3H-TdR掺入法检测B细胞的增殖能力,ELISA法检测B细胞分泌抗体的功能。结果分别以F(ab’)2anti-μ和IgG anti-μ激活SLE患者B细胞后,细胞内[Ca2+]i反应、cmp值及IgG分泌量的比值均显著低于正常人(P<0.01),通过转染FcγRⅡb1基因后,这些比值均显著提高(P<0.01或P<0.05)。结论转染FcγRⅡb1基因能有效纠正SLE患者B细胞过度的活化、增殖及抗体分泌。

类风湿关节炎患者外周血单核细胞FcγRⅡb表达及其与骨关节损害的相关性分析

目的探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单核细胞FcγRⅡb表达及其与骨关节损害的相关性。方法选取2018年1月至12月本院收治的35例初治RA患者纳入观察组,并以1∶1的比例配对选取同期于本院体检的35例健康成人纳入对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测两组研究对象外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA的表达水平,采用酶联免疫吸附测定检测两组研究对象血清可溶性FcγRⅡb(sFcγRⅡb)、与IgG结合的可溶性FcγRⅡb(sFcγRⅡb-IgG)和抗FcγRIIb抗体含量,分析其与RA患者改良Sharp评分的相关性。结果观察组患者外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA表达水平、血清sFcγRⅡb、抗FcγRⅡb抗体水平均显著低于对照组(均P<0.05),血清sFcγRⅡb-IgG水平显著高于对照组(P<0.05)。RA患者外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA表达水平、血清sFcγRⅡb、抗FcγRⅡb抗体水平与改良Sharp评分均呈显著负相关(均P<0.05)。结论RA患者外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA表达水平降低与骨关节损害显著相关,或可作为判断RA病情严重程度的生物标志物。

类风湿关节炎患者外周血B细胞FcγR Ⅱb表达

目的探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血B细胞亚群FcγRⅡb的表达及其临床意义。方法流式细胞仪检测20例初治RA患者及年龄性别匹配的15名健康对照者外周血B细胞FcγRⅡb的表达;评估其与RA病情指标的相关性。统计学分析采用独立样本t检验及Pearson相关分析。结果 RA患者记忆性B细胞亚群百分率[(18.30±8.94)%]低于健康对照组[(32.31±13.67)%],差异有统计学意义(t=3.665,P=0.001);初始B细胞亚群百分率[(78.11±9.00)%]高于健康对照组[(64.24±13.23)%],差异有统计学意义(t=-3.691,P=0.001);RA患者外周血CD19+CD27+记忆性B细胞表面FcγR IIb平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)[(7 571.95±4 494.53)%]显著低于健康对照组[(13 304.87±6 568.19)%],差异有统计学意义(t=3.068,P=0.004);RA患者外周血记忆性B细胞表面FcγRⅡb的MFI与RA患者的Ig G水平呈负相关(r=-0.732,P=0.007)。结论 RA患者外周血记忆性B细胞FcγR IIb表达低于健康对照,并与RA患者的Ig G水平呈负相关,FcγRⅡb表达异常可能在RA免疫发病机制中起重要作用。

猪FcγR ⅡB多种剪接异构体的基因克隆与序列分析

目的:研究猪FcγRⅡB受体基因选择性剪接的多样性。方法:根据GenBank中猪FcγRⅡB(swFcγRⅡB)cDNA基因序列(DQ026064),应用Primer5.0软件设计合成了一对特异性引物,应用RT-PCR技术,从不同个体的猪肺泡巨噬细胞中扩增FcγRⅡB基因并进行测序分析,在GenBank中查找猪FcγRⅡBDNA序列(NW-001886241.1),并用相关软件分析其外显子组成。结果:共克隆出6个转录体,其中转录体2,4在信号肽部分都有一个丙氨酸的缺失。转录体5,6是两个新型的FcγRⅡB转录体,转录体5胞外区只有一个Ig结构域,转录体6是一个只含有一个Ig结构域的推导性可溶性Fc受体。结论:猪FcγRⅡB的表达因RNA选择性剪接方式不同而呈现出多样性。

人FcγR Ⅱ b1基因真核载体的构建、表达及其对B细胞增殖的影响

目的构建人FcγRⅡb1基因的真核表达载体并转染人B细胞,观察其在B细胞的表达及其对细胞增殖的影响。方法分离健康人外周血B细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA,采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的人FcγRⅡb1基因片段,将双酶切产物通过T4 DNA连接酶定向插入pIRES2-EG FP真核载体相应位点中,经酶切及双向测序鉴定其序列的正确性。通过电穿孔法将pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1重组载体转入人B细胞中,采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率及细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平,采用3H-TdR掺入法检测转染FcγRⅡb1基因对B细胞增殖能力的影响。结果酶切及测序鉴定pIRE S2-EGFP-FcγRⅡb1重组质粒基因序列完全正确,重组质粒转染细胞的效率为15.5%,转染细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平显著增高,并显著抑制了B细胞增殖能力。结论成功构建了pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1真核表达载体,并赋予了FcγRⅡb1分子发挥免疫抑制功能的作用。

FcεRⅡ的研究进展

1966年Ishizaka 发现IgE,以后对IgE抗体系统研究取得很大成果。早期的研究局限在IgE 介导的变态反应,近十年来IgE 生物合成与调节、IgE 的Fc 受体(FcεR)已成为许多研究的主题。人和动物肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的FcεR 已被鉴定。

FcγRⅡ表达水平与儿童特发性血小板减少性紫癜相关性的研究

探讨外周血FcγRⅡ表达水平与儿童特发性血小板减少性紫癜（ITP）的相关性。方法 采用流式细胞技术检测40例ITP患儿以及14例健康儿童外周血单个核细胞FcγRⅡ表达，病例组根据血小板水平及临床症状分为单用糖皮质激素组（GC组）、单用静脉丙种球蛋白组（IVIG组）及糖皮质激素联合静脉丙种球蛋白组（GC+IVIG组），治疗完成后第2天使用同样的方法检测外周血单个核细胞FcγRⅡ表达。结果 ITP患儿治疗前外周血单个核细胞FcγRⅡ表达（25.63±9.74）%明显高于对照组健康儿童（10.75±6.16）%，差异有统计学意义（P＜0.01）；GC组和GC+IVIG组免疫治疗后外周血单个核细胞FcγRⅡ表达均较治疗前升高[（27.78±9.85）%比（17.43±5.76）%、（31.84±10.09）%比（27.07±10.36）%]，差异有统计学意义（P＜0.05），而IVIG组免疫治疗后与治疗前比较未见明显改变[（25.50±8.92）%比（27.13±6.72）%]，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 ITP患儿外周血单个核细胞FcγRⅡ表达变化与机体免疫功能紊乱相关，GC及IVIG可能通过不同途径影响血小板的破坏从而起到治疗效果。检测外周血单个核细胞FcγRⅡ表达在儿童ITP的诊断和治疗中具有重要意义。

FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型与汉族人群慢性牙周炎关系的研究

目的探讨FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型与慢性牙周炎敏感性的关系。方法收集63例重度慢性牙周炎(CP)患者、103例轻中度慢性牙周炎患者及80名健康对照者的颊粘膜拭子,提取DNA,采用序列特异性引物PCR(PCR-SSP)法及等位基因特异性引物PCR(PASA)法测定FcγRⅡA和FcγRⅢB的基因多态性,比较FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型在各组间分布的差异。结果FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型在重度CP组与健康对照组之间的分布有显著性差异(P<0.0125),而在轻中度CP组与对照组、重度CP组与轻中度CP组之间分布无显著性差异(P>0.0125)。结论FcγRⅡA-R131-FcγRⅢB-NA2复合基因型与慢性牙周炎的严重程度相关,提示其可能与汉族人群慢性牙周炎的敏感性相关。

三七注射液对阿霉素诱导的肾纤维化大鼠FcγRⅡa(CD32a)蛋白及C反应蛋白的影响

目的探究三七注射液对于经阿霉素诱导的肾脏发生纤维化病变的大鼠FcγRⅡa(CD32a)蛋白与C反应蛋白(C-reaction protein,CRP)的影响。方法选取144只Sprasue-Dawley(SD)大鼠,并将其随机分成4组:正常组、模型组、假手术组以及三七注射液组,每组36只。选取给药后第4、8、12周分别处死4个处理组中12只大鼠。采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各处理组中大鼠CRP的血清含量,以及采用免疫印迹试验(Western Blot)进行FcγRIIa蛋白定量分析,间接免疫荧光染色技术共聚焦显微镜下观察大鼠肾小管上皮细胞表面FcγRⅡa蛋白荧光表达。结果(1)与假手术组比较,模型组大鼠各时间点血清CRP的水平均增高(P<0.01);而与模型组相同时间点比较,三七注射液组大鼠各时间点血清CRP的水平均较低(P<0.01,P<0.05)。(2)与假手术组对比,模型组FcγRⅡa蛋白表达的水平随时间的推移下调(P<0.01),并且从第4周~第12周呈逐渐下降趋势。三七组FcγRⅡa蛋白表达较正常组和假手术组下调(P<0.01),三七组FcγRIIa蛋白表达水平较模型组高(P<0.05或P<0.01)。(3)假手术组FcγRⅡa蛋白绿色荧光表达很强,模型组随着造模时间的延长FcγRⅡa蛋白绿色荧光表达减弱,经过三七组治疗以后FcγRⅡa蛋白绿色荧光表达明显增强。结论三七注射液可能通过干预阿霉素诱导的肾纤维化大鼠FcγRⅡa蛋白与CRP相互作用,从而阻断CRP介导的炎症反应,发挥抗肾纤维化作用。

上调巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能

目的构建大鼠FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,观察其对巨噬细胞的作用。方法以大鼠肝脏mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒四环素(Tet)顺式应答元件(TRE),构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒调节质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和调节病毒,测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和调节病毒共感染巨噬细胞,经梯度浓度强力霉素(DOX)诱导,免疫荧光技术检测巨噬细胞FcγRⅡB表达,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。经不同浓度DOX诱导后的腹腔巨噬细胞分别检测吞噬和趋化功能。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。表达和调节病毒滴度均达到106转导单位/m L。巨噬细胞被病毒感染后经DOX诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示,FcγRⅡB能够在巨噬细胞表达;实时荧光定量PCR和Western blot结果显示FcγRⅡB表达水平与DOX浓度呈正相关。巨噬细胞的吞噬和趋化功能与FcγRⅡB表达呈负相关。结论调节巨噬细胞FcγRⅡB的表达可抑制其吞噬和趋化功能。

上调小鼠骨髓来源树突状细胞FcγRⅡb表达可抑制其抗原提呈功能

目的构建FcγRⅡb慢病毒载体,感染小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC),观察BMDC抗原提呈功能变化。方法小鼠骨髓细胞中提取RNA,反转录后进行PCR扩增得到FcγRⅡb目的基因,将FcγRⅡb基因插入慢病毒表达载体TRE中构建FcγRⅡb重组慢病毒载体。HEK293T细胞包装慢病毒,体外进行小鼠BMDC的诱导培养及鉴定。将慢病毒感染BMDC后,实时定量PCR检测BMDC中FcγRⅡb mRNA水平,Western blot法检测BMDC中FcγRⅡb蛋白水平,流式细胞术分析BMDC表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的变化。结果成功构建FcγRⅡb重组慢病毒载体,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定成功。体外诱导培养BMDC,可见细胞表面大量树枝样突起形成。包装慢病毒感染BMDC后,FcγRⅡb mRNA和蛋白水平均较未感染BMDC增高。流式细胞术分析感染后BMDC表面分子CD80、CD86、CD40、MHC II的表达量均较未感染BMDC下降。结论DC上FcγRⅡb的过表达能够下调其抗原提呈功能。

含人FcγRⅡB基因慢病毒的制备及其在HT-1080细胞中的表达

目的构建FcγRⅡB慢病毒诱导表达载体,并鉴定其在细胞中的表达。方法以人mRNA为模板逆转录获得FcγRⅡB基因片段,并将其克隆入慢病毒表达质粒TRE,构建TRE-FcγRⅡB慢病毒表达重组质粒。将慢病毒表达重组质粒TRE-FcγRⅡB、慢病毒可诱导质粒Tet分别与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,分别包装表达病毒和可诱导病毒,分别测定表达病毒和可诱导病毒感染滴度。表达病毒和可诱导病毒共感染HT-1080细胞,经梯度浓度强力霉素(Dox)诱导,实时定量PCR检测FcγRⅡB mRNA表达,免疫荧光染色检测HT-1080细胞FcγRⅡB表达,Western blot法检测FcγRⅡB蛋白表达。结果重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定,测序结果显示插入片段碱基序列与GenBank提供FcγRⅡB基因序列同源性100%。表达病毒滴度达106TU/mL,可诱导病毒滴度达105TU/mL,感染性良好。HT-1080细胞被病毒感染后经Dox诱导表达FcγRⅡB,免疫荧光染色结果显示FcγRⅡB能够在HT-1080细胞中表达;实时荧光定量PCR和Western blot法结果显示FcγRⅡB表达水平与诱导剂浓度正相关。结论成功制备了FcγRⅡB慢病毒,感染HT-1080细胞后可实现FcγRⅡB的诱导表达。