扶正活血抗癌方合并化疗治疗胃癌（术后）的临床与实验研究

扶正活血抗癌方治疗中晚期胃癌（术后）患者３５例，与对照组３４例比较，有较好的临床疗效，胃癌患者Ｔ淋巴细胞的免疫功能显著好转，高凝状态明显改善，ＯＫＴ４／ＯＫＴ８比值、抗凝血酶Ⅲ（ＡＴ－Ⅲ）、纤溶总活力（Ｆａ）等指标与正常值无显著差异，提高了胃癌患者１年、３年、５年的生存率（Ｐ＜０．０５）。扶正活血抗癌方对移植性人体胃癌裸鼠有明显抑制癌肿生长作用，与对照组比较，Ｐ＜０．００１；无明显毒性，与化疗药物５－氟脲嘧啶（５－Ｆｕ）比较，不影响裸鼠体重的正常增长。提示：该方不仅能扶助正气、改善血运、增强机体免疫功能，延长生存期，可能对胃癌细胞也有直接抑制、杀灭作用，这有待进一步研究。

工程化人胃癌裸鼠原位模型的建立及其活体荧光成像观察

目的建立工程化人胃癌裸鼠原位模型,并利用活体荧光成像技术进行观察。方法以胶原为支架材料,表达绿色荧光的人胃癌BGC823-EGFP细胞为种子细胞,建立人胃癌体外模型;倒置显微镜观察肿瘤细胞生长状态;通过注射将体外模型移植到裸鼠体内;活体荧光成像评估胃癌原位模型的建立;解剖观察原位肿瘤的移植成功率,生长及转移情况;冰冻切片及HE染色进行组织学观察。结果工程化人胃癌体外模型中肿瘤细胞呈立体生长;原位肿瘤成瘤率100%,可见腹腔重要脏器转移;组织学特征呈典型低分化腺癌;活体荧光观察可见原位肿瘤形成,但效果不理想。结论建立了工程化人胃癌裸鼠原位模型;绿色荧光成像效果较差,活体荧光成像观察应选用穿透力较强的荧光。

金龙蛇颗粒对裸鼠原位移植人胃癌MKN-45细胞凋亡的影响

目的：评价金龙蛇颗粒对裸鼠原位移植入胃癌MKN-45细胞的抑制作用.方法：50只裸鼠建立原位移植人胃癌MKN-45细胞模型,随机分为模型组,金龙蛇颗粒高、中、低剂量组和5-FU干预组.各组裸鼠予以相应药物实施干预.观察各组荷瘤裸鼠一般情况,肿瘤生长情况及抑瘤率.流式细胞仪检测肿瘤细胞周期分布及细胞凋亡情况.采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶（Annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide,Annexin V-FITC/PI）双标记染色法鉴别早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞.电镜下观察肿瘤细胞的超微结构变化.结果：金龙蛇颗粒高、中、低剂量组的抑瘤率分别为68.13%、55.94%和50.31%,呈剂量依赖效应,与5-FU干预组抑瘤率比较,差异无统计学意义.金龙蛇颗粒各剂量组肿瘤细胞凋亡率为22.81%～38.54%,亦呈剂量依赖效应,且肿瘤细胞主要被阻滞于G0/G1期.AnnexinV-FITC/PI双标记染色结果显示,金龙蛇颗粒各剂量组以早期凋亡细胞居多,5-FU干预组则以晚期凋亡细胞和坏死细胞居多.结论：金龙蛇颗粒对裸鼠原位移植人胃癌MKN-45细胞具有较好的抑制作用,促进MKN-45细胞凋亡可能是其抗肿瘤治疗的主要作用机制之一.

七甲川菁近红外荧光染料对胃癌原位移植模型的靶向识别

目的研究七甲川菁近红外荧光(NIRF)染料在胃癌原位移植模型活体成像中的应用效果。方法将标记荧光酶素的人胃癌细胞系Hep G2原位移植裸鼠建立肿瘤模型,同时诱发制备胃溃疡模型;对上述模型分别采用生物发光成像和NIRF成像,观察胃癌组织对近红外荧光染料的吸收;探索缺氧和阴离子转运肽(OATP)对胃癌组织吸收NIRF染料的影响,明确NIRF染料靶向识别肿瘤细胞的特异性。结果 NIRF信号与生物发光信号在胃癌原位移植模型活体成像中具有较好的相关性。胃癌组织部位可获得较强的NIRF荧光信号,而胃溃疡部位未检测到荧光信号。缺氧能够增强胃癌细胞对NIRF染料的吸收,而阴离子转运肽特异性抑制剂磺溴酞钠(BSP)能够显著降低肿瘤细胞对NIRF染料的吸收。结论七甲川菁近红外荧光染料能够靶向识别胃癌原位移植模型。

消水散对人胃癌小鼠腹膜移植模型B7/CD28/CTLA-4协同刺激通路及腹水微环境的影响

目的 研究消水散对人胃癌小鼠腹膜移植模型B7/CD28/细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)协同刺激通路及腹水微环境的影响。方法 2019年4月至2020年5月,在湖南省中医药研究院动物中心实验室,采用腹腔注射人胃癌细胞MGC803建立人胃癌小鼠腹膜移植模型,共分为模型组、消水散低、中、高剂量组,另取正常小鼠为对照组,每组10只。通过行为学观察及测定血清促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺激素(TSH)含量评估模型质量,影像学方法评估恶性腹水情况,流式细胞仪及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测B7-1、B7-2、CD28及CTLA-4表达量及其mRNA表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹膜组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-10(IL-10)表达水平。结果 正常小鼠的阳虚症状积分为(0.00±0.00)分,血清ACTH水平为(103.46±10.13)ng/L、CORT水平为(81.34±9.21)μg/L、T3含量为(178.52±15.86)ng/L、T4含量为(213.59±16.97)μg/L和TSH含量为(10.84±1.15)mIU/mL。与对照组相比,模型小鼠阳虚症状积分[(7.84±1.59)分]显著增加(P<0.05),血清ACTH[(71.09±6.42)ng/L]、CORT[(43.42±7.14)μg/L]、T3[(103.77±13.24)ng/L]、T4[(127.64±13.25)μg/L]、TSH含量[(8.14±1.02)mIU/mL]显著降低(P<0.05)。模型组小鼠的腹水量为(5.18±0.46)mL、瘤体积为(1.23±0.12)cm3、瘤重为(1.73±0.15)g、B7-1 mRNA水平为(1.06±0.10)、B7-2 mRNA水平为(1.04±0.11)、CD28 mRNA水平为(0.97±0.08)、CTLA-4 mRNA水平为(1.03±0.09)、TGF-β1含量为[(181.73±15.26)pg/g]和IL-10水平为[(68.74±6.03)pg/g]。与模型组相比,消水散低、中、高剂量组小鼠的腹水量[(4.03±0.41)、(3.24±0.25)、(2.33±0.27)mL]、瘤体积[(0.93±0.09)、(0.49±0.05)、(0.16±0.02)cm3]、瘤重[(1.42±0.13)、(0.79±0.11)、(0.27±0.08)g]、CTLA-4 mRNA水平[(0.83±0.07)、(0.42±0.05)、(0.16±0.02)]、TGF-β1[(152.69±12.39)、(131.45±11.68)、(107.26±10.52)pg/g]、IL-10[(51.65±5.38)、(34.28±2.73)、(27.13±2.64)pg/g]表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.05),B7-1[(2.13±0.22)、(4.56±0.51)、(7.29±0.68)]、B7-2[(1.95±0.14)、(4.32±0.41)、(6.83±0.63)]、CD28[(2.02±0.15)、(3.94±0.28)、(7.11±0.84)]mRNA水平逐渐增加(P<0.05)。结论 消水散可抗人胃癌移植瘤恶性腹水作用,可能与抑制CTLA-4表达,促进T细胞激活,改善机体免疫抑制及腹腔免疫微环境有关。

胃癌腹膜种植瘤动物模型的构建

目的建立稳定实用的人胃癌鼠腹膜种植瘤模型。方法通过对裸鼠和SCID鼠腹腔注射胃癌细胞株AGS、NCI—N87和SNUl6构建腹膜种植瘤模型，比较不同细胞株模型成功率和生存期的差异。结果裸鼠腹腔种植5×106个AGS、NCI—N87和SNUl6细胞腹膜瘤形成率分别是（3／8、6／8和2／8；SCID鼠腹腔种植5×106个AGS、NCI—N87和SNUl6细胞，腹膜瘤形成率分别是0／6、6／6和6／6。SCID鼠腹膜瘤模型中位生存期：NCI—N87细胞组（10x10。）为74d；SNUl6细胞3个不同剂量组（10×106、20×106和40×106）分别为95、78和44d。结论SCID鼠腹腔种植（20—40）×106个SNUl6细胞可以构建稳定实用的胃癌腹膜种植瘤模型。

胃癌灶原位移植腹膜转移癌裸小鼠模型的建立及生物学性状鉴定

目的建立胃癌灶原位移植腹膜转移癌裸小鼠模型，鉴定其侵袭转移生物学特点。方法取11只BALB／C裸小鼠，将人MGC-803胃癌组织原位移植于胃窦部，建立裸小鼠人胃癌灶原位移植腹膜转移癌模型。测定裸鼠体质量、血常规，并采用肿瘤组织形态学及免疫组织化学方法观察肿瘤增生、凋亡及侵袭转移相关分子标志[B淋巴细胞／白血病（bcl）-2、bcl-6、原位末端转移酶标记（TUNEL）、细胞核增殖抗原（Ki-67）、CD34、D2-40、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）-9]。结果模型制作成功率100％（11／11），生存期内裸鼠体质量平缓增加。常规病理学检测瘤块重量为210．5—379．0mg（中位数267．5mg），癌细胞异质性明显，微血管／淋巴管中癌栓易见，可见胃周淋巴结及肝脏转移。肿瘤增殖相关分子检测显示bcl-2阳性率为0．0％～10．4％（中位数为3．3％），bcl-6阳性率为0．0％-11．1％（中位数为3．3％），Ki-67阳性率为40．5％-48．6％（中位数为45．4％），TUNEL阳性率为0．2％-3．1％（中位数为0．9％），肿瘤侵袭转移相关分子检测肿瘤组织血管标记CD34观察到1—11（中位数为3）个脉管／视野，通过淋巴管标记D2-40观察到0—5（中位数为2）个脉管／视野，分泌VEGF的阳性细胞为68．5％～95．8％（中位数82．4％），MMP-9阳性细胞数为13．5％-50．0％（中位数为23．5％）。结论成功建立胃癌灶原位移植腹膜转移癌裸小鼠模型，并表现出了低分化胃腺癌的典型生物学特点。

抗癌消水散对人胃癌小鼠腹腔移植阳虚模型的干预作用

目的:研究抗癌消水散对人胃癌小鼠腹腔移植阳虚模型的影响。方法:采用腹腔注射人胃癌细胞MGC803及冰水建立人胃癌小鼠腹腔移植阳虚模型,将造模成功的50只小鼠分为模型组及抗癌消水散低、中、高剂量组,每组各10只,另取10只正常小鼠为对照组。干预30 d后评价阳虚症状积分,测定血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT)、三碘甲状腺原氨酸(T_(3))、甲状腺素(T_(4))、促甲状腺激素(TSH)含量及B7-1、B7-2、CD28、胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)含量,检测腹膜组织中B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28 mRNA、CTLA-4 mRNA及转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素-10(IL-10)含量,观察腹水量、瘤体积、瘤重。结果:与正常组比较,模型组阳虚症状积分显著增加,血清ACTH、CORT、T_(3)、T_(4)、TSH水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。抗癌消水散低、中、高剂量组小鼠腹水量、瘤体积、瘤重,血清中B7-1、B7-2、CD28、CTLA-4含量,腹膜组织中B7-1、B7-2、CD28 mRNA、CTLA-4 mRNA及TGFβ1、IL-10含量与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);上述指标低、中、高剂量组组间比较,差异亦有统计学意义(P<0.05),以高剂量组改善为最佳。结论:抗癌消水散具有抗人胃癌小鼠移植阳虚模型瘤恶性腹水的作用,这可能与抑制CTLA-4表达,促进T细胞激活,改善机体免疫抑制及腹腔免疫微环境有关。

胃肠安对人胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤中乏氧相关蛋白表达的影响

目的:观察MGC-803人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型经胃肠安干预后对其相关乏氧蛋白表达的影响,探讨胃肠安对MGC-803人胃癌转移的作用机制。方法:选用BALB/C裸鼠,以人胃癌MGC-803细胞在其皮下注射建立移植瘤模型,随机分为3组并给予相应干预,分别为胃肠安组(胃肠安煎剂0.3 ml灌胃,1次/d)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)组(5-Fu 1 mg腹腔注射,1次/周)、模型组(0.9%Na Cl溶液0.3 ml灌胃,1次/d),干预时间均为8周。用免疫组化法检测乏氧相关蛋白包括乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、赖氨酰氧化酶(LOX)、类赖氨酰氧化酶2(LOXL2)、结缔组织生长因子(CTGF)的表达。结果:胃肠安组裸鼠胃癌组织乏氧相关蛋白HIF-1α、TGF-β1、LOX、LOXL2、CTGF表达均较模型组明显降低,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:胃肠安能明显降低人胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤中HIF-1α、TGF-β1、LOX、LOXL2、CTGF的表达,提示胃肠安可能通过下调乏氧相关蛋白的表达而起到抑制肿瘤转移的的作用。