应用CRISPR/Cas9技术制备MrgD基因敲除小鼠模型

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立MrgD基因敲除的小鼠模型,为研究MrgD基因在糖、脂代谢中的作用提供实验工具。方法根据MrgD基因第一外显子碱基序列,设计针对MrgD基因的sgRNA(single guide RNA),构建sgRNA表达质粒,利用T7RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9后,将Cas9 m RNA和sgRNA对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射。使用基因测序检测MrgD基因碱基的突变情况。结果获得了MrgD基因突变的F2代纯合子小鼠,即MrgD基因缺失173bp的小鼠。并且,初步研究显示MrgD基因纯合突变小鼠在普通饲料喂养下糖、脂代谢正常。结论成功构建了MrgD基因敲除小鼠动物模型,为探讨MrgD基因在糖尿病发生发展中的作用提供研究平台。

MrgD通过抑制内质网应激调节肝癌细胞脂肪酸代谢

目的抑制脂肪酸和胆固醇的合成可以有效降低肝癌细胞脂肪积累或脂质代谢,从而抑制肝细胞癌发生。本研究旨在探讨MrgD对肝癌细胞脂肪代谢的作用及机制。方法借助慢病毒包装的重组MrgD表达质粒及MrgD干扰质粒,分别建立稳定性过表达和低表达MrgD的HepG2细胞株。利用游离脂肪酸诱导构建体外细胞脂肪变性模型,通过油红O染色、以及检测脂肪合成相关基因(SREBP2,ACC1)以及ERS标记蛋白(ATF6)水平评估MrgD对肝细胞脂肪代谢的影响和机制。结果成功构建过表达和低表达MrgD的稳转HepG2细胞。在FFA诱导的HepG2细胞脂肪变性模型中,MrgD过表达细胞的脂滴沉积少于对照组;而在低表达MrgD细胞中观察到相反的趋势。同时MrgD过表达降低了HepG2细胞经脂肪酸诱导后脂肪合成及ERS的相关基因蛋白水平。对应的低表达MrgD细胞中上述蛋白表达水平则较对照组明显上调。结论本研究在体外初步揭示了MrgD通过调控内质网应激抑制肝癌细胞脂肪合成,结果提示MrgD途径可能参与肝细胞癌的发展。