新型冠状病毒Omicron I1566V突变位点MS2噬菌体病毒样颗粒的构建

目的构建新型冠状病毒Omicron I1566V突变位点MS2噬菌体病毒样颗粒。方法选取并合成带有6×His标签的MS2噬菌体的衣壳蛋白(CP)、成熟蛋白(A蛋白)及Omicron I1566V突变基因序列,插入pACYCDuet-1质粒构建重组载体,通过原核系统诱导表达目的蛋白,纯化重组蛋白后利用透射电镜对蛋白质进行物理表征,最后通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测病毒样颗粒的热稳定性及耐核酸酶水解能力。结果成功构建包含有6×His标签的CP、A蛋白和Omicron I1566V突变基因序列的重组载体,经限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切鉴定和测序验证,结果均与预期相符。经诱导并纯化后,通过电镜观察到了大小均匀、直径为23~28 nm的病毒样颗粒,该病毒样颗粒经核酸酶消化后可在37℃条件下稳定储存20 d以上。结论该研究成功利用MS2噬菌体的CP和A蛋白构建了Omicron I1566V突变位点病毒样颗粒,为该突变位点的RT-PCR检测体系提供了可靠的质量保障。

7种不同成分消毒剂对MS2噬菌体杀灭效果的比较

以MS2噬菌体为指示微生物,检验了7种不同成分的消毒剂(双氧水、乙醇、发酵乳酸消毒剂、络合碘消毒剂、复合季铵盐消毒剂、含氯消毒剂和过氧乙酸消毒剂)对噬菌体的杀灭效果.结果表明,被广泛使用的消毒剂对病毒杀灭的效果差异较大.络合碘消毒剂具有最强的杀灭作用,其次为复合季铵盐消毒剂和过氧乙酸消毒剂,而双氧水、乙醇和发酵乳酸消毒剂的杀灭效果较差.该试验结果可为合理配置消杀环境中有害微生物的消毒剂提供参考依据.

噬菌体MS2和φX174的双层琼脂平板和液体培养基扩增方法的建立

噬菌体MS2和φX174曾广泛作为指示病毒,用来研究病毒在土柱和田间实验条件下的迁移行为。本文详细介绍了实验室小规模双层琼脂平板扩增和大规模高复数感染法制备纯噬菌体溶液的条件和方法步骤。宿主细菌E.coli(ATCC 15597)的最佳培养时间为90～120min,而E.coli(ATCC 13706)的最佳培养时间为120～150min,在上述时间段内,它们的生长分别进入对数期。小规模双层琼脂平板扩增方法耗时、耗力,但用高复数感染扩增方法可获取一次大量(约500ml)的高浓度纯噬菌体MS2和φX174溶液,它们的含量分别可达1011pfu/ml和108pfu/ml。

易组“太谷核不育基因”(Ms2 )基因定位的研究

将在远缘杂交中由普通小麦 (AABBDD) 4D染色体易组导入六倍体小黑麦 (AABBRR)以及硬粒小麦 (AABB)的太谷核不育基因Ms2 (原位于普通小麦 4D染色体短臂距着丝点 31.2cM的显性雄性不育核基因 )重新导回普通小麦染色体组中。所获携带易组Ms2基因的新型太谷核不育小麦其显性雄性不育特性表达正常 ,且雄性不育株的雌性可育机制正常 ,对不育株幼穗花粉母细胞减数分裂期染色体构型的观察可见其为整倍体 (2n =4 2 ) ,尚未发现回归普通小麦的易组太谷核不育基因与原位点的太谷核不育基因有不同的表型。采用系统的标志基因测交法对回归普通小麦的易组太谷核不育基因进行了测交定位 ,发现易组Ms2基因与普通小麦显性矮秆标志基因Rht3连锁 ,从而将其定位于普通小麦 4B染色体短臂距Rht3基因 9.7cM处 ,新位点被命名为Ms2 (4BS)。对Ms2基因在六倍体小黑麦与原太谷核不育小麦远缘杂交中易位时的走向 ,普通小麦 4A与 4B染色体的互换更名以及Ms2 (4BS)新位点的开发利用进行了讨论 :认为异源多倍体生物核基因的组间易位倾向于从供体染色体向进化亲缘关系较密切 ,且染色体序数与染色体臂相同的部分同源染色体易位 ;1988年第 7届国际小麦遗传学会对普通小麦 4A与 4B染色体的互换更名是正确的 ;Ms2 (4BS)

Bartington MS2和Kappabridge MFK1-FA不同频率的磁化率在黄土、红粘土和湖相沉积物中的应用

通过Bartington MS2和Kappabridge MFK1-FA两种仪器对黄土-古土壤、红粘土和湖相沉积物样品进行了5个频率的磁化率测试,并计算得到了4个频率磁化率.通过对比分析不同类型样品磁化率-频率变化曲线可知,当样品中细颗粒磁性矿物含量较高时,磁化率在较低频率即可达到峰值,而当样品中细颗粒磁性矿物含量较低时,磁化率在较高频率时才能达到峰值.因此,在黄土-古土壤等样品的应用中,成壤作用较强,细颗粒亚铁磁性矿物含量较高,Bartington MS2的低频(465Hz)与Kappabridge MFK1-FA的F1(976Hz)和F2(3905Hz)频率均处于磁化率峰值区域,可以检测到SP/SD阀值区域颗粒的信息,但是对于红粘土和湖相沉积物等细颗粒亚铁磁性矿物含量较低的样品,磁化率峰值对应的频率较高,MS2型磁化率仪无法有效地检测其中细颗粒的含量,而MFK1-FA中F2(3905 Hz)和F3(15616 Hz)两个频率间的频率磁化率则可以较好地完成这一任务.

甘蓝型油菜隐性核不育两用系S45AB中与MS2Bnap基因同源片段的克隆及序列分析

以甘蓝型油菜隐性核不育两用系 S4 5 AB的可育株和不育株为材料 ,提取减数分裂期与单核期的花粉 m RNA,反转录合成 c DNA,并以其为模板扩增花粉特异基因 MS2 Bnap。结果减数分裂期能扩出产物 ,而单核期无任何产物。将减数分裂期的扩增产物克隆、测序。同源性分析表明 :在 S4 5 AB上克隆的 MS2 Bnap基因与 Gene Bank公布的拟南芥控制核育性基因 MS2和已报道的甘蓝型油菜的 MS2 Bnap基因的同源性分别为 88%和 99%。可育株 S4 5 B与不育株S4 5 A在 MS2 Bnap基因序列上有 4处碱基存在差异 ,其中 3处为同义突变 ,编码氨基酸未发生变化 :1处为错义突变 ,可育株为 AAA,不育株为 AGA。其三联体密码对应的氨基酸也发生了变化 ,AAA编码赖氨酸 ,AGA编码精氨酸。该变化可能与 S4 5

亚麻中雄性不育基因同源序列MS2-F的克隆和表达分析

用同源序列克隆法从亚麻中克隆了雄性不育基因同源序列MS2-F cDNA(登陆号:EU363493)。该cDNA全长1911bp,包含一个1608bp的ORF,编码535个氨基酸。推导的蛋白质序列中包含2个雄性不育保守区:NAD结合区域和雄性不育C-末端区域。该基因与油菜和拟南芥雄性不育基因的一致性分别为59.65%和59.16%,为花蕾特异表达基因,推测在亚麻花粉发育过程中与脂酰辅酶A还原酶有相似功能。MS2-F cDNA对应的gDNA大小为2696bp(登陆号:EU365361),含有8个内含子和9个外显子。

MS2和T4噬菌体对短波紫外线抵抗力的比较研究

[目的]观察MS2和T4两种噬菌体对短波紫外线(UVC)抵抗力的变化,确定不同强度UVC有效灭活两种噬菌体的时间,为寻找最适噬菌体作指示病毒用于UVC灭活病毒效果的评价提供依据。[方法]噬菌体悬液在一定紫外线强度下照射不同的时间,最后采用双层琼脂平板法分别测定照射前后的噬菌体滴度,绘制照射前后噬菌体的灭活曲线(t-Δlog),并在不同紫外线强度下进行测定。[结果]MS2噬菌体在UVC照射下:370 μW/cm2,10min,或680 μW/cm2,5min,或1130 μW/cm2,3min,达到消毒水平(LIV≥4.00log10),LIV分别为4.49 log10、4.52 log10和4.16 log10;T4噬菌体则为370 μW/cm2,20min,或680 μW/cm2,15min,或1130 μW/cm2,5min,达到消毒水平,LIV分别为4.60 log10,4.02 log10和5.46 log10。[结论]在本实验条件下,对短波紫外线的抵抗力:T4噬菌体﹥MS2噬菌体。

利用交错延伸剪接PCR技术扩增油菜花粉育性基因MS2 Bnap全长cDNA序列

交错延伸剪接PCR是一种用于分子进化研究的DNA改组技术。本实验利用其原理 ,将已获得的油菜花粉育性基因MS2Bnap有部分序列重叠的三段PCR产物作为模板进行扩增 ,获得了花粉育性基因MS2Bnap的全长cD NA序列。

基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品的制备

【目的】利用MS2噬菌体外壳蛋白可在体外自组装并包封外源核酸的特点,制备RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品,并研究其稳定性和耐Rnase降解特性。【方法】选择猪流行性腹泻病毒保守性强的N蛋白基因为靶序列,插入到携带有MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点基因的下游,构建重组载体,经原核表达系统,表达重组蛋白,目的蛋白经过硫酸铵和凝胶过滤层析纯化,以及Benzonase核酸酶消化,利用电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过Taqman荧光RT-PCR验证盔甲RNA热稳定性及耐Rnase攻击能力。【结果】成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白、PAC位点和猪流行性腹泻病毒靶基因的重组载体。经过原核表达和纯化,得到均一的、直径为23~28 nm的MS2病毒样颗粒,该颗粒经核酸酶消化、RNA提取和荧光RT-PCR,证实其形成了包封靶基因的盔甲RNA。该盔甲RNA可以耐受Rnase的降解,并且无菌条件下可在37℃稳定存在15 d。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白体外包封PEDV N蛋白靶序列制备的病毒样颗粒,可以作为RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒的质控品(盔甲RNA),其热稳定性好,耐Rnase攻击,可全程监控整个检测过程。

RNA病毒检测质控物质—大肠杆菌噬菌体MS2标准样品的研制和应用

目的研制大肠杆菌噬菌体MS2标准样品,以其作为RNA病毒检测质控物质,建立RNA病毒检测全过程的质量控制体系。方法利用液体培养法制备大肠杆菌噬菌体MS2标准样品;采用双层琼脂法对标准样品进行稳定性、均匀性测定并定值;将标准样品添加于贝类样品中,应用于贝类诺如病毒实时荧光检测全过程质量控制。结果该标准样品稳定性与均匀性良好,定值为(1.57±0.0288)×10^(11) pfu/m L;保质期为12个月;在4种不同贝类样品中,病毒提取效率在3.70%~7.84%之间,符合国际标准ISO 15216:2-2013的病毒提取效率大于1%的要求。结论该研究制备的大肠杆菌噬菌体MS2标准样品可以对RNA病毒检测全过程进行良好的质量控制,具有良好的应用前景。

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

[目的]研究MS2基因的功能。[方法]采用RT-PCR克隆棉花花粉育性(MS2)基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chi-nase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。[结果]成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。[结论]该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。

实时荧光RT-PCR与普通RT-PCR检测噬菌体MS2的差异

目的:通过比较实时荧光一步RT-PCR和普通的两步法RT-PCR在检测噬菌体MS2时灵敏度和特异性的差异,以期在消毒学、微生物等相关试验中选择灵敏度和特异性能满足所需的一种方法检测噬菌体或类似病毒。方法:采用实时荧光一步RT-PCR法和普通的两步法RT-PCR对噬菌体MS2复制酶基因和衣壳蛋白基因进行检测,比较两种方法对两个基因片段的检测灵敏度和特异性。结果:对于复制酶基因,实时荧光RT-PCR的灵敏度达0.25 pg/μl,普通的两步法RT-PCR为2500 pg/μl;而对于衣壳蛋白基因,前者灵敏度达0.025 pg/μl,后者为250 pg/μl。在所用的10种菌(毒)株的特异性检测中,实时荧光一步RT-PCR法只检测到噬菌体f2和大肠杆菌ATCC15597(MS2的宿主菌)有与噬菌体MS2复制酶基因和衣壳蛋白基因均相应的两种荧光信号,而其它菌(毒)株为阴性结果;两步法RT-PCR电泳图谱只显示出噬菌体f2有一条与噬菌体MS2衣壳蛋白基因相当的条带以及大肠杆菌ATCC15597有一条与MS2复制酶基因大小相当的条带,其它菌(毒)株的电泳图谱无相关条带。结论:对于噬菌体MS2的检测,实时荧光一步RT-PCR法的灵敏度比普通的两步法RT-PCR高104倍,但特异性后者略强于前者。

诺如病毒检验用大肠杆菌噬菌体MS2标准物质的研制

目的制备均匀性和稳定性符合要求的大肠杆菌噬菌体MS2标准物质,用于诺如病毒检验过程质量控制。方法对大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)进行分子生物学确认。采用冷冻干燥技术制成微球状标准物质,并进行均匀性、长期稳定性、短期稳定性检验。以牡蛎等5种样品作为基质,对使用效果进行确认。结果制备的样品呈球形、白色、大小均一,其均匀性符合要求,经-20℃12个月长期储存,样品稳定,经4℃28 d以及37℃5 d的短期储存,样品稳定。阈值循环数(threshold cycle,Cq)值与均匀性检平均值差异不大。牡蛎等5种样品使用效果确认实验表明,该标准物质可以作为食品诺如病毒检验过程质量控制使用。结论大肠杆菌噬菌体MS2(CMCCPh001)分子水平鉴定结果符合大肠杆菌噬菌体MS2特征。均匀性、长期稳定性、短期稳定性及适用性实验结果符合作为诺如病毒检验过程质量控制标准物质的要求。

MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合特异性及其生物学应用进展

MS2噬菌体为正义单链RNA噬菌体,基因组含有3569个核苷酸,编码成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白。MS2噬菌体复制酶编码基因5'端一个由19个碱基组成的茎环结构(又称包装位点)是衣壳蛋白二聚体与RNA相互作用的部位,二者相互作用形成的复合物是启动噬菌体自我包装的信号。MS2噬菌体衣壳蛋白与包装位点结合的特异性已被应用于RNA病毒核酸检测的标准物质、校准品和质控品的研究,实时动态监测活细胞内RNA的运动,以及RNA体内递送载体的研究等领域。

有机干扰物影响纳米Ag液灭活噬菌体MS2效果的实验研究

[目的]通过有机干扰物牛血清白蛋白(BSA)的存在与否比较研究纳米Ag液对噬菌体MS2的不同灭活效果,为纳米Ag在生活及环境中的实际应用提供基础资料。[方法]采用悬液定量灭活试验测定纳米Ag液对噬菌体MS2的灭活对数值(LIV)。[结果]在不加有机干扰物BSA时,100mg/L纳米Ag液作用60min,对噬菌体MS2的灭活对数值LIV为4.01log10,400mg/L作用20min,其LIV达4.12log10;而加入3%的BSA后,400mg/L纳米Ag液作用1440min(24h),对噬菌体MS2的LIV为3.61log10,800mg/L作用90min,其LIV为4.02log10。[结论]环境中有机干扰物的存在将会极大程度地降低纳米Ag液对噬菌体MS2的灭活效果。

玉米核不育基因(ms2)对杂交种的效应研究

用核不育系（ｍｓ２／ｍｓ２）配制的４ 个杂交种与相应常规杂交种进行产量和农艺性状比较，研究ｍｓ２ 基因对杂交种产量和农艺性状的影响－ 结果表明，核不育基因ｍｓ２ 对杂交种产量无显著影响，对株高、穗位高、生育时期等农艺性状也无明显不良反应，ｍｓ２ 基因对杂交种的株高、穗位高、吐丝时期和抽雄至吐丝间隔的效应因品种不同而有差异－

超临界二氧化碳提取物中生育酚的LC/APCI-MS2测定(英文)

确定了一种简单,明确和灵敏的高效液相测定和检测超临界二氧化碳萃取物中生育酚的方法。通过加入携带剂,超临界二氧化碳从菜籽脱臭馏出物提取生育酚浓缩物,其分析在反向色谱柱ZorbaxC18上,用98%甲醇作为流动相,UV检测波长为292nm,α-生育酚作标准物。此方法线性相关性较高。APCI-MS和APCI-MS2检测的各生育酚的m/e与理论预测值一致。

MS2噬菌体介导展示猪繁殖与呼吸综合征病毒线性表位的嵌合纳米颗粒制备及免疫原性

【目的】以MS2噬菌体外壳蛋白为载体,构建展示猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白上线性表位的嵌合纳米颗粒,并研究其免疫原性,为猪繁殖与呼吸综合征病毒或其他病毒表位展示提供新的方法和思路。【方法】利用重叠延伸PCR将GP5上优势线性表位基因序列插入到MS2噬菌体外壳蛋白基因上,构建重组载体,通过原核表达系统表达嵌合蛋白,目的蛋白经过硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析纯化,用动态光散射和电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过蛋白印迹和动物免疫试验研究表位嵌合颗粒的免疫原性。【结果】成功将线性表位基因插入MS2噬菌体外壳蛋白基因,嵌合蛋白在原核表达系统中以水溶性表达,目的蛋白经过纯化,纯度达85%以上。嵌合蛋白在体外自组装形成了均一的、直径为25~31 nm的嵌合表位纳米颗粒,该嵌合颗粒免疫动物后,产生可以和灭活病毒反应的高水平抗体,具有良好的免疫原性。【结论】MS2噬菌体外壳蛋白可以耐受9个外源多肽(猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5上线性表位)的插入,在体外自组装形成嵌合病毒样颗粒。该颗粒将外源多肽高密度展示在表面,免疫动物可产生针对该表位的抗体。该技术可为猪繁殖与呼吸综合征病毒其他表位或更长串联表位的展示奠定基础。

亚麻MS2-F基因的RNAi表达载体构建

亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。