苜蓿MsDREB1基因的诱导表达增强大豆的耐盐性

基因转录调节是植物对非生物胁迫适应机制的一个重要方面,转录调节因子在胁迫信号转导途径中调节下游基因的表达,在建立植物对胁迫适应性过程中起到重要作用。DREB是功能多样的转录调节因子蛋白家族,家族成员在植物响应非生物胁迫方面扮演着重要角色。本研究以苜蓿MsDREB1基因为目的基因,分别把MsDREB1克隆到35S启动子与rd29A启动子之后,并把两种载体用农杆菌介导转入大豆基因组中,通过Southern检测转基因植株。15 d龄的幼苗在200 mmol·L^(-1)NaCl胁迫条件下,用RT-PCR分析基因不同时间的表达差异;并测定叶绿素、丙二醛、H_2O_2、SOD、相对根长及相对地上部分长度。结果表明:转MsDREB1基因在两种启动子驱动下均有一定耐盐能力,但存在差异。在非胁迫下35S启动子调控的MsDREB1为超量表达,而rd29A启动子调控MsDREB1表达量较低;在盐胁迫下,rd29A:MsDREB1表达量高于35S:MsDREB1的表达量;MsDREB1超量表达抑制植株正常生长。MsDREB1诱导表达耐盐性效果更明显,其植株脯氨酸含量、SOD活性均显著高于MsDREB1超量表达,而H_2O_2和MDA含量则显著低于MsDREB1超量表达。结果说明MsDREB1作为转录调节因子参与了植物的渗透调节,对植物的耐盐性具有贡献。该试验研究两种启动子调控的转MsDREB1基因大豆耐盐效果,为MsDREB1基因在大豆耐盐基因工程中的应用提供参考。

紫花苜蓿转录因子MsDREB1基因表达产物的亚细胞定位

利用生物信息学方法对紫花苜蓿MsDREB1进行了生物信息学分析.结果表明,该序列含有AP2典型结构域,在N端存在核定位信号.为进一步验证该基因功能,构建MsDREB1与绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein,GFP)基因融合的植物表达载体pCAMBIA1302-MsDREB1,再利用基因枪将其转入洋葱表皮细胞,在共聚焦扫描显微镜下观察MsDREB1基因表达产物在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位.结果表明,MsDREB1基因表达产物定位于细胞核中,符合DREB家族转录因子特性.

过表达苜蓿MsDREB1基因大豆耐旱性分析

本研究目的是利用转基因技术改良大豆(Glycine max)的耐旱性,并研究rd29A和CaMV-35S两类启动子的驱动效果。利用构建的转基因载体p CAMBIA-rd29A-MsDREB1和p CAMBIA-35S-MsDREB1,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法,将苜蓿(Medicago sativa)基因DREB1导入大豆品种‘中黄13号’,获得rd29A和CaMV-35S两类启动子驱动的MsDREB1转基因大豆。对T_1至T_2代植株进行PCR、Southern blot分析,分别筛选到9和12个转基因大豆株系,各随机选择两个转基因株系作为研究对象。正常水分状态下初花期统计大豆株高及叶面积。苗龄30 d的植株在不同干旱胁迫条件下,用逆转录定量PCR(RT-q PCR)分析基因表达差异,测定叶绿素含量、丙二醛含量、相对含水量及植株干重,并分析各株系干旱后复水的成活率。结果表明,两种启动子对MsDREB1表达的调控存在明显差异,在非胁迫下35S启动子调控的MsDREB1为超量表达,而rd29A启动子调控的MsDREB1表达量较低;在严重干旱胁迫下,rd29A:MsDREB1表达量高于35S:MsDREB1表达量;MsDREB1超量表达抑制植株正常生长。两种启动子各转基因株系均有一定耐旱能力,但存在差异。MsDREB1诱导表达耐旱性效果更明显,在中度干旱胁迫下,其植株相对含水量、叶绿素含量、单株干重均显著高于MsDREB1超量表达,而丙二醛含量显著低于MsDREB1超量表达。结果说明MsDREB1作为转录调节因子参与了植物的干旱调节。该研究为MsDREB1基因在大豆耐旱基因工程中的应用提供方法。

紫花苜蓿DREB1基因的原核表达与蛋白纯化

构建MsDREB1基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为研究DREB1基因在植株中功能奠定基础。用冷酚法从紫花苜蓿提取RNA,并转化成cDNA,然后将其克隆至pET32a原核表达载体,构建重组载体pET32aDREB1。用重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析,用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析,出现了与DNAMAN预测的43.2 kd大小一致的蛋白条带;经分析重组蛋白纯化率达到90%以上。