1株中度嗜盐菌质粒基因组文库的构建及2个膜蛋白基因的克隆和序列分析

中度嗜盐菌是生活在高盐环境中的微生物,以1株从蜢子虾酱中分离的中度嗜盐菌盐脱氮枝芽胞杆菌(Virgibacillus halodenitrificans)为研究对象,通过酶切,筛选DNA片段然后连接pUC19载体并转化大肠埃希菌,构建了该菌株的质粒基因组文库,推测可获得5×103个阳性克隆,覆盖约15 Mb的遗传信息。随机选取部分克隆进行测序,在测序结果中筛选到了2个具有完整ORF的膜蛋白基因分别为编码Na+H+逆向转运蛋白的NhaC基因,编码一离子通道蛋白的MscS基因,GenBank登陆号分别为JX849200、JX849202。其中NhaC基因ORF全长为1 446 bp,编码481个氨基酸,包括10个跨膜结构域;MscS基因的全长ORF为822 bp,编码273个氨基酸的蛋白质,包括3个跨膜区,与其他菌种的序列比对表明第3个跨膜区保守性最强。

TRAIL基因修饰脐带间充质干细胞联合5-氟尿嘧啶对U-87MG、A549及HeLa细胞杀伤作用研究

目的研究TRAIL基因修饰的脐带间充质干细胞(TRAIL-MSCs)联合化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)对人脑胶质瘤细胞U-87MG、人肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞HeLa的杀伤作用。方法通过基因工程手段结合慢病毒转染体系构建高表达十二聚体TRAIL蛋白(dTRAIL)的TRAIL-MSCs,应用流式细胞技术检测TRAIL-MSCs的生物学特性;通过ELISA技术检测TRAIL-MSCs分泌的TRAIL量来评估转染效果;CCK-8法检测低浓度(0、1、2、4、8、16μg/mL)5-FU对U-87MG、A549、HeLa细胞的增殖抑制率,并计算其对各细胞的半数抑制浓度(IC_(50));CCK-8法检测5-FU(IC_(50))、UC-MSCs培养上清、TRAIL-MSCs培养上清、5-FU(IC_(50))+UC-MSCs培养上清和5-FU(1/4 IC_(50)、1/2 IC_(50)和IC_(50))+TRAIL-MSCs培养上清对U-87MG、A549、HeLa细胞的增殖抑制率,计算5-FU和TRAIL-MSCs培养上清的相互作用系数(CDI);Western blotting法检测5-FU对U-87MG、A549、HeLa细胞死亡受体DR4、DR5蛋白表达的影响;台盼蓝染色法观察5-FU、UC-MSCs、TRAIL-MSCs、5-FU+UC-MSCs和5-FU+TRAIL-MSCs对U-87MG、A549、HeLa细胞的杀伤作用。结果生物学检测结果表明TRAIL-MSCs在维持UC-MSCs生物学特性的同时能够高表达TRAIL蛋白。5-FU对U-87MG、A549、HeLa细胞均有增殖抑制作用,抑制作用由高到底依次为HeLa细胞(IC_(50)为9.15μg/mL)>A549细胞(IC_(50)为10.62μg/mL)>U-87MG细胞(IC_(50)为22.37μg/mL)。与对照组比较,除A549细胞UC-MSCs培养上清组外,各处理组细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.01、0.001);与相应各5-FU IC_(50)及TRAIL-MSCs培养上清组比较,U-87MG、HeLa细胞5-FU(1/4 IC_(50)、1/2 IC_(50)和IC_(50))+TRAIL-MSCs培养上清组细胞增殖抑制率均显著升高(P<0.001),A549细胞5-FU(IC_(50))+TRAIL-MSCs培养上清组细胞增殖抑制率显著升高(P<0.01、0.001);5-FU(1/2 IC_(50))+TRAIL-MSCs培养上清组对U-87MG的细胞增殖抑制协同效应最显著(CDI<0.7且P<0.001);5-FU(1/4 IC_(50))+TRAIL-MSCs培养上清组对A549的细胞增殖抑制具有协同作用,但其协同效果并不显著;5-FU(1/4 IC_(50))+TRAIL-MSCs培养上清组对HeLa细胞增殖抑制的协同效果最显著(CDI<0.7且P<0.01)。经5-FU处理后U-87MG、A549、HeLa细胞DR4和DR5的蛋白表达明显升高,其中DR5的表达水平高于DR4,与对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.001)。与对照组比较,5-FU、TRAIL-MSCs和5-FU+TRAIL-MSCs组对于肿瘤细胞U-87MG、A549、HeLa均具显著的杀伤作用(P<0.001);与5-FU或TRAIL-MSCs组比较,5-FU+TRAIL-MSCs组的杀伤效果更显著(P<0.001)。结论TRAIL-MSCs联合低浓度的5-FU对肿瘤细胞U-87MG、A549和HeLa具有显著的细胞杀伤作用,二者联用协同效果显著,机制可能与5-FU提高DR4、DR5蛋白表达、提高肿瘤细胞对TRAIL-MSCs的敏感性相关。