γδT细胞TCR分子与Mtb-Ag表位结合的初步探讨

探讨采用毛细管电泳(CE)法分离检测结核杆菌抗原(Mtb-Ag)的活性成分能与γδT细胞TCR分子进行表位结合.试验温度25℃;电泳毛细管:熔融石英毛细管55cm(40cm处检测窗口)×50μm i.d.;进样压力0.5 psi;进样时间5.0s;缓冲溶液浓度为0.05mol·L^(-1)(p H=10.20)的乙酸钠溶液;分离电压+15 k V.该方法能依据相对分子质量大小分离Mtb-Ag样品活性成分.样品加标回收率为96.75%,相对标准偏差低于7.45%.采用CE法分离检测Mtb-Ag样品中的活性成分能与γδT细胞TCR分子进行表位结合.

Xpert MTB/RIF在利福平耐药可靠性和时效中的评估

目的:探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Xpert MTB/RIF)在利福平耐药可靠性及时效评估方面的应用价值.方法:选取2017年8月-2018年9月笔者所在医院肺科门诊接诊的300例初诊肺结核可疑患者,分别实施Xpert MTB/RIF及常规固体培养检测,比较两种方法对患者的诊断结果.以临床综合诊断为金标准,对肺结核患者使用利福平治疗,比较传统药敏试验及Xpert Mtb/RIF对耐药性的检测结果.同时,比较常规固体培养及传统药敏试验、Xpert Mtb/RIF的诊断时效,包括肺结核诊断用时、耐药性诊断用时、肺结核诊断成本、耐药性诊断成本.结果:Xpert Mtb/RIF的肺结核阳性检出率及阳性符合率均高于常规固体培养(P<0.05);Xpert Mtb/RIF的耐药阳性符合率高于传统药敏试验(P<0.05);Xpert Mtb/RIF对肺结核诊断用时、耐药性诊断用时均短于常规固体培养及传统药敏试验,肺结核诊断成本、耐药性诊断成本均少于常规固体培养及传统药敏试验,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:Xpert MTB/RIF可提高肺结核早期检出率,保证利福平耐药检出可靠性,且诊断用时更少,成本更低,具有较高的诊断时效,值得推广和应用.

T细胞的扩增及其信号转导分子ZAP-70的检测

目的检测Y6T细胞信号转导分子ξ链相关蛋白-70（ξ-chain associated protein70，ZAP-70）。方法分离获取健康人PBMC，用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）刺激PBMC，通过流式细胞仪检测总T细胞和Y6T细胞CD69分子的动态表达；Mtb-Ag活化γδT细胞增殖培养，10d后收集细胞，用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞；western blot方法检测俩T细胞内的ZAP-70分子。结果总T细胞和γδT细胞均在活化刺激24h时表达CD69分子达高峰，但总T细胞仅为16％，γδT细胞可达75．2％；新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4．9％，Mtb-Ag刺激培养10d后升为69．2％，免疫磁珠阳性分选后达99．3％；检测γδT细胞内的ZAP-70分子。结论Mtb—Ag可特异性激活γδT细胞，用Mtb-Ag刺激γδT细胞活化增殖培养，可获得大量的γδT细胞；成功地检测到细胞内ZAP-70分子，这为γδT细胞内其它分子的检测分析奠定方法学基础，也为进一步检测γδT细胞活化信号转导过程中ZAP-70分子的激活及作用奠定基础。

结核杆菌抗原特异性激发人γδT细胞活化信号涉及Ras/Erk途径

目的 :探讨Ras Erk通路是否参与结核杆菌低分子多肽抗原 (Mtb Ag)启动的γδT细胞活化信号转导途径。方法 :分离获取PBMC ,用佛波醇酯 (PMA)和离子霉素 (IM) ,CD3mAb或Mtb Ag刺激不同时间 ,或PBMC先经PD980 5 9处理后再刺激培养 ;用荧光单抗染色后在流式细胞仪测定细胞CD6 9分子的表达 ;计数培养扩增 10天的细胞数量。结果 :PBMC用PMA +IM刺激 6小时 ,总T细胞和γδT细胞中的CD6 9表达均达高峰 (均 >99% ) ,用CD3mAb刺激 2 4小时 ,均达高峰 (均在 5 5 %左右 ) ,用Mtb Ag刺激 2 4小时 ,亦均达高峰 ,但总T细胞和γδT细胞中CD6 9分别为 16 .0 %和 75 2 % ;用PD980 5 9预处理PBMC ,可明显抑制Mtb Ag激活的γδT细胞CD6 9表达和γδT细胞的增殖。结论 :Mtb Ag可特异性激活γδT细胞 ,其活化信号转导需通过Ras Erk通路。

一种简单快速扩增和获取外周血γδT细胞的方法(英文)

本研究目的是建立一种简单快速的扩增人外周血γδT细胞的方法 ,以便用于γδT细胞的生物学特性和临床过继性免疫治疗的研究。取人外周血 5 - 10ml,分离获取单个核细胞 ,用结核杆菌低分子多肽抗原 (MTb Ag)刺激细胞增殖 ,通过荧光单克隆抗体TCRγδ PE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例 ,用MTT试验检测细胞毒活性。结果表明 :MTb Ag能特异地刺激外周血单个核细胞中的γδT细胞增殖 ,γδT细胞可达 6 9.2 % ,对K5 6 2细胞具有较高的杀伤活性。结论 :本方法是一种简单、快速、特异的体外扩增和获取人外周血γδT细胞的方法。

毛细管电泳法检测结核杆菌蛋白多肽类抗原活性成分研究

采用毛细管电泳法分离检测结核杆菌耐热抗原样品中的活性成分。熔融石英毛细管55cm(40cm处检测窗口)×50μm i.d.;缓冲液:0.15mol·L-1硼酸盐(含5g·L-1PEG-4000,pH=10.92);分离电压:+12 kV;进样压力:0.5 psi(3.45 kPa),进样时间3.0s;分离温度:25℃;UV-Vis检测器检测波长:200nm。本方法能分离溶菌酶标准蛋白和牛血清白蛋白标准品,根据分子量大小能有效分离结核杆菌耐热抗原样品活性成分,线性回归方程相关系数r2在0.99673以上,定量限在19.47μg·mL-1左右。样品加标回收率在96.09%左右,相对标准偏差小于8.13%,本方法与快速蛋白液相色谱法结果一致。该方法简便、灵敏、快速、可靠、重现性好,能用于结核杆菌耐热抗原样品中活性成分测定。

结核杆菌抗原激活MEK-ERK信号通路延迟中性粒细胞自发性凋亡的作用

探讨结核杆菌抗原(Mtb-Ag)对中性粒细胞自发性凋亡的影响。取健康成人外周血分离中性粒细胞,加Mtb-Ag培养24 h,或用Mek抑制剂PD98059预处理30 min,Annexin V染色流式细胞术观察细胞凋亡;并用Western blot印迹法检测Mek活化情况。与中性粒细胞体外培养24 h后自发凋亡(55%±6%)相比,加入Mtb-Ag(1.125 mg/ml)后,中性粒细胞凋亡率(31%±3%)明显降低;并且Mtb-Ag可诱导Mek的激活;而PD98059(50μmol/L)预处理可阻断Mtb-Ag的抑制凋亡作用。Mtb-Ag对中性粒细胞自发凋亡有抑制作用,这一作用涉及Mek-Erk途径。

3种检测方法对不同年龄组肺结核疑似患者诊断价值的对比分析

目的分析结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert Mtb/RIF)、T细胞斑点试验(T-SPOT)和抗酸染色涂片法对不同年龄组可疑肺结核患者的诊断价值。方法选取224例疑似肺结核患者为研究对象,根据年龄分为少年及青年组、中年组和老年组,分别采用Xpert Mtb/RIF、T-SPOT和抗酸染色涂片法对各组患者的肺泡灌洗液或痰液标本进行检测。结果以临床诊断结果为金标准,少年及青年组Xpert Mtb/RIF、T-SPOT和抗酸染色涂片法检测的灵敏度分别为63.2%、63.2%和26.3%,特异度分别为95.5%、90.9%和100.0%;中年组Xpert Mtb/RIF、T-SPOT和抗酸染色涂片法检测的灵敏度分别为43.5%、60.9%和4.3%,特异度分别为93.7%、86.1%和98.7%;老年组Xpert Mtb/RIF、T-SPOT和抗酸染色涂片法检测的灵敏度分别为40.0%、60.0%和20.0%,特异度分别为91.8%、83.7%和98.0%。少年及青年组和中年组Xpert Mtb/RIF和T-SPOT两种检测方法的灵敏度均明显高于抗酸染色涂片法,差异有统计学意义(P<0.05);老年组3种检测方法的灵敏度比较,差异无统计学意义(P>0.05),但抗酸染色涂片法特异度明显高于T-SPOT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Xpert Mtb/RIF和T-SPOT两种方法在少年及青年和中年疑似肺结核患者的诊断中有较明显的优势,对老年疑似肺结核患者的诊断可根据具体情况选择合适的检测方法。

结核杆菌抗原特异性激活和扩增γδT细胞

目的探讨用结核杆菌低分子多肽抗原激活和扩增γδT细胞的方法。方法分离获取健康人PBMC，用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb—Ag）或CD3mAb刺激PBMC，通过流式细胞仪检测总T细胞和佛细胞CD69分子的动态表达（6～72h）及细胞增殖培养10d后78T细胞的比例，用MTT试验检测细胞毒活性。结果对Mtb—Ag的刺激，总T细胞和柙细胞均在活化刺激24h时表达CD69分子达高峰，但总T细胞仅为16．0％，γδT细胞可达75．2％；新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为（5．37±0．64）％（n=5），在刺激培养10d后，CD3mAb组为（1．37±0．38）％（n=5），Mtb—Ag组为（69．67±1．46）％（n=5）。结论Mtb—Ag可特异性激活T细胞，用Mtb—Ag刺激T细胞活化增殖培养，可获得大量的T细胞。

T细胞的扩增及其信号转导分子ZAP-70的检测

目的检测γδT细胞信号转导分子ζ链相关蛋白-70（ζ-chainassociated protein70，ZAP．70）。方法分离获取健康人PBMC，用结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb．Ag）刺激PBMC，通过流式细胞仪检测总T细胞和丫6T细胞CD69分子的动态表达；Mtb-Ag活化俩T细胞增殖培养，10d后收集细胞，用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞；westernblot方法检测γδT细胞内的ZAP．70分子。结果总T细胞和γδT细胞均在活化刺激24h时表达CD69分子达高峰，但总T细胞仅为16％，γδT细胞可达75．2％；新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4．9％，Mtb-Ag刺激培养10d后升为69．2％，免疫磁珠阳性分选后达99-3％；检测到Y6T细胞内的ZAP-70分子。结论Mtb-Ag可特异性激活俩T细胞，用Mtb-Ag刺激γδT细胞活化增殖培养，可获得大量的γδT细胞；成功地检测到细胞内ZAP-70分子，这为Y6T细胞内其它分子的检测分析奠定方法学基础，也为进一步检测γδT细胞活化信号转导过程中ZAP-70分子的激活及作用奠定基础。

结核杆菌抗原活化的γδT细胞中ZAP-70的酪氨酸磷酸化特点

目的 观察结核杆菌抗原 (Mtb Ag)活化的γδT细胞信号转导分子ZAP 70酪氨酸磷酸化的特点。方法 用Mtb Ag和抗CD3单克隆抗体 (CD3McAb)体外刺激人外周血单个核细胞(PBMC) ,诱导活化 ,在含IL 2的培养液中扩增培养 ,分别获得Mtb Ag激活的T细胞 (MtbAT)和CD3McAb激活的T细胞 (CD3AT)。再分别用Mtb Ag和CD3McAb刺激 ,在不同时间内提取细胞裂解液 ,用抗 酪氨酸磷酸化蛋白抗体作免疫沉淀 ,用抗ZAP 70单克隆抗体进行免疫印迹。结果 MtbAT中γδT细胞可达 6 0 %～ 80 % ,CD3AT中CD3+ 细胞可达 90 %以上 ,而γδT细胞 <10 % ;MtbAT细胞用Mtb Ag再刺激后 15min时出现ZAP 70的酪氨酸磷酸化 ,30min达高峰 ,可持续到 6 0～ 12 0min ,而CD3AT用CD3McAb再刺激后仅在 5min时检测到ZAP 70的磷酸化。结论 与CD3McAb对普通T细胞的作用比较 ,Mtb Ag刺激可优先活化γδT细胞 ,其对γδT细胞ZAP 70活化的特点是 :较慢、较强。

结核杆菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T细胞对诱导γδT细胞CD69分子再次表达的影响

目的 观察结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）再刺激Mtb-Ag活化的T细胞（Mtb-AT细胞）诱导γδT细胞CD69分子的再表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC）,用Mtb-Ag刺激PBMC,采用直接免疫荧光染色法通过CD3PE/CD69FITC、γδPE/CD69FITC细胞双染检测γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的表达情况.PBMC经Mtb-Ag刺激活化扩增培养至10 d后再次加入Mtb-Ag,经培养0、6、12、24、48和72 h后收集细胞,再次检测CD69分子的表达情况.结果 培养0、6、12、24、48和72 h后,Mtb-Ag初次刺激γδT细胞后CD69分子的表达分别为0.91％、15.1％、35.2％、75.2％、59.4％和50％.再次刺激培养0、6、12、24、48和72 h后,γδT细胞CD69分子的表达分别为1.7％、72.3％、73.5％、50.3％、45.6％、41.7％.结论Mtb-Ag初次刺激γδT细胞表达CD69分子约在24 h达高峰,随后快速下降;Mtb-Ag再次刺激Mtb-AT细胞诱导γδT细胞CD69分子的再表达,6h时CD69分子达高峰,可维持到12 h.这为寻求γδT细胞迅速活化、CD69分子的迅速表达奠定了方法学基础.

痰样结核杆菌抗原85B mRNA检测在肺结核疗效评价中的应用

目的探讨痰样结核杆菌抗原85B m RNA检测在结核疗效评价中应用。方法比较痰涂片抗酸染色、MTB-IS6110 DNA、改良罗氏培养和MTB-抗原85B m RNA在检测治疗0、2、4、8、12周的结核患者痰液结核杆菌阳性率。结果治疗0周、2周和12周时四种方法检测差异无统计学意义;治疗4周、8周时四种方法阳性率总体差异有统计学意义(χ2=23.167,P<0.05;χ2=18.196,P<0.05),其中MTB-IS6110 DNA和改良罗氏培养差异有统计学意义(χ2=17.03,P<0.05;χ2=14.428,P<0.05);MTB-IS6110 DNA和MTB-抗原85B m RNA之间差异无统计学意义(χ2=2.865,P>0.05;χ2=3.262,P>0.05)。治疗4周时改良罗氏培养和MTB-抗原85B m RNA差异没有统计学意义(χ2=6.377,P>0.05),而治疗8周时差异有统计学意义(χ2=4.97,P<0.05)。结论 MTB-IS6110 DNA检测灵敏度最高,可作为初筛,MTB-抗原85B m RNA real-RT-PCR和改良罗氏培养两者一致性较好,且灵敏度和特异性更高,可作为结核病人治疗监测。

三种方式活化T细胞CD69分子表达观察

目的观察CD3单克隆抗体（CD3mAb）、佛波醇酯＋离子霉素（PMA＋IM）、结核杆菌低分子多肽抗原（Mtb-Ag）活化CD3＋T细胞CD69分子的表达情况。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（PBMC），用CD3mAb（A组）、PMA＋IM（B组）、Mtb．Ag（C组）刺激PBMC，采用流式细胞术检测。CD3＋T细胞和∞T细胞0、6、12、24、48和72hCD69分子的动态表达情况。结果CD3＋T细胞CD69分子的动态表达情况：CD3mAb刺激组24h达高峰，为56．2％；PMA＋IM刺激组6h达高峰，为99．5％；Mtb-Ag刺激组24h达高峰，为16％。各组比较F=322．528，P〈0．001；两两比较，均P〈0．001。γδT细胞CD69分子的动态表达情况：CD3mAb刺激组24h达高峰，为55．1％；PMA＋IM刺激组6h达高峰，为99．3％；Mtb-Ag刺激组24h达高峰，为75．2％。各组比较F=21．170，P〈0．001；两两比较：CD3mAb与PMA＋IM组比较，PMA＋IM组与Mtb—Ag组比较，均P〈0．001；Mtb-Ag与CD3mAb比较P=0．646。结论PMA＋IM的刺激，CD3＋T细胞和γδT细胞活化达高峰的用时比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要短，CD69的表达率也比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要高，应作为三种方法中CD3＋T细胞活化的首选方法。