牛磺酸对糖尿病大鼠视网膜Mller细胞凋亡的防护研究

目的观察高糖培养条件及牛磺酸干预视网膜Mller细胞的凋亡变化,探讨牛磺酸对早期糖尿病视网膜Mller细胞的保护作用。方法取出生后3d的SD大鼠视网膜,分离纯化培养视网膜Mller细胞;经预实验选取25mmol/L葡萄糖作为高糖培养条件,实验分为6组:正常组;高糖+0.1mmol/L牛磺酸组;高糖+1mmol/L牛磺酸组;高糖+5mmol/L牛磺酸组;高糖+10mmol/L牛磺酸组,用原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测视网膜Mller细胞凋亡并观察牛磺酸的防护效应。结果神经胶质酸性蛋白(glia1fibrillary acid protein,GFAP)和S-100荧光双染鉴定纯化培养的视网膜Mller细胞均被双染;牛磺酸干预后TUNEL阳性细胞数量明显减少,并呈一定剂量的关系效应,1～10mmol/L牛磺酸干预TUNEL阳性细胞显著低于高糖培养组(P<0·01)。结论牛磺酸能够呈剂量依赖性地抑制高糖所致视网膜Mller细胞凋亡。

脑源性神经营养因子对急性高眼压后大鼠视网膜 Müller 细胞的影响

目的：检测脑源性神经营养因子(BDNF)干预急性高眼压后大鼠视网膜 Müller 细胞谷氨酰胺合成酶(GS) 和谷氨酸/天冬氨酸转运体(GLAST)表达的变化,探讨 BDNF 保护节细胞(RGCs)的可能机制。方法：成年大鼠分为3个 BDNF 干预组和3个溶媒对照组并进行玻璃体内注射。2 d 后将预处理动物左眼眼压升高至闪光视网膜电图 b 波消失的临界眼压且维持缺血60 min。实验动物分别存活1、3或7 d 后通过免疫组织化学检测大鼠视网膜 GS 和 GLAST 的表达变化。结果：与正常对照组比较,溶媒对照组 GS 和 GLAST 在存活1 d 和3 d 时表达上调,7d 时下降；BDNF 干预组未出现表达明显变化。结论：BDNF 可能不是通过 Müller 细胞上调 GS 和 GLAST,降低胞外 Glu 来保护 RGCs。

缺氧对视网膜Müller细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的探讨缺氧对体外培养的大鼠视网膜M櫣ller细胞血管内皮生长因子(vas-cular endothelial growthfactor,VEGF)和色素上皮衍生因子(pigment epitheliumderived fac-tor,PEDF)表达的影响。方法采用RT-PCR和Western印迹分析方法分别对不同缺氧时间视网膜M櫣ller细胞VEGF和PEDF的mRNA及蛋白水平进行测定。结果M櫣ller细胞VEGF mRNA及蛋白表达在缺氧12h后明显升高,缺氧24h更为显著,24h时2者分别为对照组的2.12倍(P<0.05)和1.70倍(P<0.05)。PEDF mRNA及蛋白表达在缺氧6h后明显下降(P<0.05),缺氧24h下降更为显著,24h时2者分别为对照组的0·11倍(P<0.01)和0.54倍(P<0.05)。结论缺氧条件下,体外培养的大鼠M櫣ller细胞VEGF和PEDF表达失衡,PEDF表达下降,同时VEGF表达增加,2者的表达失衡可能在视网膜病理性新生血管形成过程中起一定作用。

脂质体法和电穿孔法体外转染SD大鼠视网膜Mller细胞的比较

目的:探讨脂质体法及电穿孔法介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染体外培养的视网膜Mller细胞的可行性和区别。方法:体外培养出生后7～10d的SD大鼠视网膜Mller细胞,免疫荧光染色法鉴定95%以上为视网膜Mller细胞。分别用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导的脂质体转染法和电穿孔法将质粒PEGFP-N1转染视网膜Mller细胞,荧光显微镜下检测转染后1,2,3,4d的转染效率,并持续观察至转染后14d,比较两者基因表达持续时间。结果:荧光显微镜下检测转染后1d,两组均可见少量细胞表达EGFP绿色荧光蛋白。转染后2d,两者转染效率均达到最大,并且电穿孔法介导质粒PEGFP-N1转染Mller细胞效率约为31.0%±2.8%,较脂质体法转染效率(10.5%±2.4%)更高。两者比较有统计学意义(P<0.01)。随后,两者转染效率均逐渐降低。电穿孔转染后的PEGFP-N1可在视网膜Mller细胞内持续表达近14d,而脂质体转染后仅能表达约7d。结论:脂质体法和电穿孔法均适用于视网膜Mller细胞的基因转染,但电穿孔法效率更高,表达时间更长。

DL-α-AAA诱发恒河猴特发性黄斑旁毛细血管扩张症

目的:选择性干扰黄斑区Mller细胞,试图建立特发性黄斑旁毛细血管扩张症(idiopathic perifoveal telangiectasis,IPT)动物模型。方法:恒河猴12只随机分为6组,前3组单眼视网膜下注入DL-α-AAA(DL-α-aminoadipic acid)5,10,50mmol/L30μL,后3组单眼玻璃体腔分别注入DL-α-AAA16,50,80mmol/L100μL。术前1wk及术后6,12wk行眼底彩色照相、荧光素眼底血管造影、黄斑自发荧光、光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)、多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram,mfERG)检测,并摘除眼球行光镜检查。结果:视网膜下5,10mmol/LDL-α-AAA及玻璃体腔50mmol/LDL-α-AAA,给药后6wk均出现IPT且OCT和光镜亦有相应病理改变;视网膜下50mmol/LDL-α-AAA,及玻璃体腔80mmol/LDL-α-AAA,病理损伤严重但未出现IPT。结论:视网膜下5～10mmol/LDL-α-AAA、玻璃体腔50mmol/LDL-α-AAA均可诱发IPT。

卵巢储备功能下降患者全血细胞参数特征及其临床意义

目的:了解卵巢储备功能下降(diminished ovarian reserve,DOR)患者血细胞分析参数的变化规律,评估这些参数在DOR诊疗中的价值。方法:选取确诊的DOR女性患者132例,同期收集年龄匹配的180例健康女性为正常对照。测定所有研究对象的全血细胞参数和抗缪勒管激素(AMH)等激素。结果:DOR患者的白细胞计数(WBC)平均为6.27×10~9/L,明显高于对照组(P=0.0001);DOR患者的平均淋巴细胞计数(LYMP)为1.81×10~9/L、平均单核细胞计数(MONO)为0.34×10~9/L,均明显低于对照组(P=0.005、0.002);且WBC与AMH存在明显的负相关(r=0.156,P=0.006)。WBC预测DOR的受试者工作特征曲线(ROC)的曲线下面积(AUC)为0.626,界值为6.07×10~9/L时,敏感性和特异性分别为0.578和0.726。结论:DOR患者中WBC常高于6.07×10~9/L,提示局部轻微的慢性炎症可能参与DOR的发生、发展,WBC可以作为DOR患者的治疗和病情评估的经济、简便的实验室指标。

体外培养视网膜Müller细胞损伤后早期的反应性改变

目的:研究体外培养Müller细胞致伤后早期细胞发生的一系列损伤性变化和发生反应性胶质化的规律。方法:新生SD大鼠视网膜进行体外Müller细胞的培养并建立高压气体冲击损伤模型,检测细胞致伤后早期胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达变化,以及乳酸脱氢酶(LDH)的释放量和细胞凋亡率的变化。结果:致伤后3h左右GFAP的表达量明显增强,以后24h内持续性高表达,并与损伤强度呈正比(P<0.05);LDH的释放增加主要出现在损伤后30min内;损伤后30min各组致伤细胞凋亡率呈非显著性差异(P>0.05),3h后细胞凋亡率增高,6h后细胞凋亡率最高。结论:Müller细胞形态的改变和细胞膜通透性的改变可能是触发GFAP表达增强的因素之一。

基于偏振信息的癌变细胞特征提取技术

用于检测的偏振光中包含被测样品丰富的微观信息。细胞发生病变时,细胞结构发生变化,正常细胞与病变细胞对相同的偏振光有不同影响,通过偏振成像获取变化了的偏振特性可以进一步区分正常细胞和病变细胞。设计了一套采集前向散射偏振图像的Mueller矩阵显微成像系统,使用该系统采集了人体正常肝细胞和肝癌细胞的偏振图像。对经Matlab处理得到的Mueller矩阵图像数据进行Mueller矩阵变换,可以得到具有一定物理意义的相关参数。以肝细胞为例,采用上述方法,分析了正常细胞和病变细胞对应参数的差异性,实验结果为进一步研究癌症的早期检测和诊断方法提供了理论依据。

国产全氟化碳液体眼内存留的实验研究

目的观察国产全氟化碳液体(PFCL)眼内长期存留对眼内组织的形态学和组织学影响。方法将18只新西兰大白兔左眼随机分为3个实验组:分别在玻璃体腔注入0.3、0.6、1.0ml国产PFCL;右眼为对照组。观察手术后4、8、12周时眼内组织形态、电生理结果及组织学改变。结果实验组1、2未出现有临床意义的视网膜病变,只出现轻微的形态学改变;实验组3出现明显的形态学和组织学改变。实验观察早期(4～8周),实验组兔眼视网膜形态学和组织学改变均较轻微;晚期(8～12周)改变较显著。电生理检测结果显示,实验组3出现显著的b波振幅降低。结论少量国产PFCL长期存留眼内可引起一定的组织学改变,但不影响临床功能;大量国产PFCL存留眼内仍会对组织造成可见的毒性反应。

兔视网膜Müller细胞原代培养

目的建立成年兔视网膜Mueler细胞体外原代培养方法。方法运用组织块培养法。分离出成年兔视网膜神经感觉层，剪成1mm×1mm大小组织块，置于含有20％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液／F12培养，采用倒置相差显微镜、透射电子显微镜观察及荧光免疫组织化学染色的方法进行培养细胞的鉴定。结果培养的细胞块3d后可见部分细胞突起长出，7d后整个组织块周围放射状长出较多细胞。倒置相差显微镜下，培养细胞呈一端细胞体丰富膨大，另一端有一长突起，细胞核椭圆形，常有2个或2个以上核仁；透射电子显微镜下，细胞胞体大，细胞浆丰富，内含丰富的8～10nm的微丝。荧光免疫组织化学法显示细胞呈神经胶质纤维酸性蛋白和胞内视黄醛结合蛋白阳性，阳性率达95％以上。结论运用组织块培养法可培养出兔视网膜Mueiler细胞。

受细胞外液扰动的白细胞散射偏振特征

针对白细胞受细胞外液扰动发生形变的情况,建立了无粒白细胞的椭球核切比雪夫形光学模型。基于T矩阵方法,对线偏振光入射时形态参数及细胞核质比对白细胞散射偏振的影响进行了数值仿真,并与不受细胞外液扰动时的散射偏振特性进行了对比。研究结果表明,在侧向散射区,白细胞散射光线偏振度对外液扰动强度的变化相对于在后向散射区更为敏感,外液扰动越大对偏振的影响越大,且内核形变越大,外液扰动对白细胞散射光偏振的影响越大。

静态压力对视网膜米勒细胞表达胶质纤维酸性蛋白和热休克蛋白-70的影响

目的观察静态压力对视网膜Müller胶质细胞(RMGC)数量和表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和热休克蛋白(HSP)70的影响。设计实验性研究。研究对象大鼠RMGC。方法体外培养并鉴定大鼠RMGC,对该细胞施以不同程度的静态压力,分为A(1．33kPa)、B(2．67kPa)、C(5．33kPa)、D(10．67 kPa)四组,设立未加压者为正常对照组(NC)。用倒置相差显微镜观察细胞形态结构变化,常规细胞记数方法计算细胞数量,台盼蓝染色计算各组活细胞比例。采用蛋白电泳的方法比较各组细胞中GFAP和HSP70的表达情况。主要指标细胞形态,细胞数量,细胞活性。结果随着压力增加细胞数量降低,C和D组细胞数量低于NC组、A和B组(P＜0．01)。压力导致各组细胞拒染率降低(P＜0．01),C和D组细胞拒染率低于NC组、A和B组(P＜0．01)。C和D组细胞形态结构有明显损伤,随着压力的进一步增加,细胞的损伤程度也进一步加重。NC组RMGC表达GFAP和HSP70蛋白的水平低于压力组,C和D组GFAP表达略高于A和B组,但各压力组HSP70表达无明显差异。结论过高的静态压力会直接损伤RMGC,RMGC表达GFAP和HSP70水平升高,可能是高眼压条件下视网膜损伤反应的标志之一。(眼科,2007, 16:44-47)

CD44抗体对视网膜Müller细胞降解透明质酸功能的影响

目的观察CD44抗体对视网膜Mueller细胞降解透明质酸（HA）功能的影响。方法培养的猪后极部视网膜Mueller细胞．取第2代细胞用于实验。细胞分为1、2、3组。每组含12×10^3个Mueller细胞。其中1组培养液中未加入其他试剂；2组培养液中加入0．01mg／mlHA；3组培养液中加入0．01mg／mlHA和10μg／ml抗CD44抗体。2、3组细胞和HA、单克隆抗CD44抗体预培养．收集1、2、3组上清液．行HA-底物胶电泳法和类酶链免疫吸附测定（ELISA）法检测。结果HA-底物胶电泳法分析结果显示．1组表现为蓝色背景下的白色细淡的双条带；2组双条带明显增厚，合并成较粗和明亮的脱色条块；3组脱色条块回复为细淡的双条带。类ELISA法检测结果显示．1、2、3组口发光度[A，旧称光密度（OD）]值分别为0．310±0．025、0．093±0．051、0．025±0．069。2组A值较1组A值明显降低，与1组A值比较．差异有统计学意义（t=28．1．P〈0．01）；3组A值与1组A值比较．差异无统计学意义（t=4．92，P〉0．05），与2组A值比较．差异有统计学意义（t=26．9，P〈0．01）。结论Mueller细胞与HA的相互作用可加强细胞降解HA的功能，CD44抗体可降低这种加强作用。

Müller细胞对视网膜血管内皮细胞紧密连接蛋白表达的影响

目的探讨体外培养的Müller细胞在糖基化终末产物(AGEs)作用下增殖活性的变化,以及这种改变对牛视网膜血管内皮细胞(BREC)紧密连接蛋白(occludin)表达的影响。方法培养新生大鼠Müller细胞和BREC,两类细胞均用特异性抗体进行免疫鉴定。将培养的BREC分4组观察:第1组未添加任何细胞上清液;第2组添加正常Müller细胞上清液;第3组添加糖基化终末产物(AGEs)作用后的Müller细胞上清液;第4组无细胞组,为空白对照组。酶联免疫吸附法(ELISA)测定4组细胞上清液中紧密连接蛋白的含量,比较其变化。结果添加正常Müller细胞上清液组紧密连接蛋白表达量最多,未添加任何细胞上清液组次之,添加AGEs作用后的Müller细胞上清液组更少。结论AGEs能促进Müller细胞异常增殖、抑制BREC表达紧密连接蛋白。