桑树皱叶病毒vⅡ变种侵染性克隆的构建及其致病性鉴定

桑树皱叶病毒vⅡ变种是对桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)进行遗传进化分析发现的,其对桑树的致病性尚不清楚。利用PCR和同源重组的方法构建了农杆菌介导的含有2倍大基因间隔区(large intergenic region,LIR)的MCLV vⅡ侵染性克隆,分别接种到其天然宿主桑树和实验植物番茄植株上,以期明确MCLV vⅡ变种对桑树的致病性及对实验植物的侵染性和致病性。结果显示,桑树和番茄分别在接种45 d和25 d检测到全部侵染成功的植株,说明构建的含有2倍LIR的MCLV vⅡ侵染性克隆具有侵染性;MCLV vⅡ的侵染性克隆可以侵染番茄,且草本植物番茄接种成功率和接种响应速度都要高于和快于木本植物桑树,说明番茄可以作为MCLV研究的实验宿主;接种后检测为阳性的桑树在90 d的观察期内,其叶部没有表现出病毒感染样症状,接种后检测为阳性的番茄在45 d的观察期内未表现出任何病毒感染样症状。这些发现为双生病毒侵染性克隆的构建提供了一种新的思路,并为进一步研究MCLV与寄主互作和MCLV的应用奠定基础。

桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用

桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)是近年从感病桑树中分离鉴定的一种新的桑树病毒,该病毒属于双生病毒科。由于MCLV外壳蛋白基因(cp)序列中含有较多大肠埃希菌(Escherichia mori)BL21(DE3)的稀有密码子而限制了其在大肠埃希菌中的表达。通过人工合成DNA的方法对MCLV cp基因序列进行优化,将其中40个大肠埃希菌稀有密码子变换成同义偏爱密码子,构建优化后的MCLV cp基因的原核表达载体p GEX4T-MCLV CP并转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,经0.1 mmol/L IPTG诱导及SDS-PAGE电泳鉴定,实现了融合蛋白GST-MCLV CP在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。通过SDS-PAGE纯化后切胶回收原核表达的融合蛋白GST-MCLV CP,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MCLV CP的多克隆抗体,经间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶4 096,Western blot检测其能与MCLV发生特异性反应。用制备的抗血清对MCLV感染阳性的桑叶样品进行间接ELISA检测,其检出率仅为25%,但将桑叶样品的粗汁液煮沸处理后能显著提高MCLV的检出率,检出率达83.3%。

桑树皱叶病毒NASH检测方法的建立及应用

以非放射性物质地高辛为标记物,采用随机引物标记法获得了灵敏度高、特异性强的DNA探针,通过优化杂交时间以及上样量,建立了桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)的核酸斑点杂交(nucleic acid spot hybridization,NASH)检测体系。与PCR检测方法相比,建立的NASH检测体系准确率达93.1%。利用建立的NASH技术对江苏省镇江市3个不同地块(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)采集的60个桑叶样品进行检测以分析MCLV病毒在该地区的分布情况及与桑树病毒样病害的关系,结果显示,Ⅰ地块检出率20%,Ⅱ地块检出率90%,Ⅲ地块检出率95%,平均检出率68.3%,说明MCLV在该地区分布广泛;另外,在某些无任何病毒病症状的植株上检出MCLV,而在某些有明显花叶或萎缩症状的植株上未检测出MCLV,说明MCLV可能与桑树的花叶或萎缩症状无明显关联。

基于SYBR Green Ⅰ的桑树皱叶病毒qPCR检测方法的建立及应用

根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10^4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10^2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。