套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性和稳定性初探

目的提高标签引物-套式/多重PCR诊断疟疾的敏感性、特异性与稳定性。方法用滤纸法采集非疟疾发热病人血样30份及其他传染病(感冒,流感,伤寒,肝炎等)患者血样20份;抽取恶性疟和间日疟各1例患者血4m1,进行系列稀释制备不同疟原虫含量的感染血样;健康者血样作对照。用热裂解法制备DNA模板,用线粒体细胞色素氧化酶基因作为靶基因,应用相关软件和网络资源(PrimerPremier5.0,PUBMED,NCBI-BLAST和Mfold服务器)设计和优化标签引物-套式/多重PCR,并用于检测所采集制备的各种血样。结果间日疟与恶性疟患者血系列稀释为含1000、100、10和1个虫/μl后经标签引物-套式/多重PCR检测,恶性疟和间日疟患者各稀释含虫血样分别在611bp和255bp出现1条带,能检测到原虫密度均为1个虫/μl血;非疟疾发热病人血样30份及其他传染病患者血样均为阴性;健康者血样未出现扩增条带,每种血样反复测试3次以上均获得同样结果。结论经优化的标签引物-套式/多重PCR在疟疾诊断中具有较高的敏感性、特异性和稳定性。

套式/多重PCR检测疟疾感染的应用研究

目的了解标签引物-套式/多重PCR技术在检测疟疾感染中的现场应用价值。方法随机采取我省疟疾流行区有发热症状的居民及家庭成员的耳垂血79份,同时制作厚血片和滤纸血样本各1份,用标签引物-套式/多重PCR检测所采集滤纸血样本中的疟原虫,并与镜检法进行比较。结果79份样本中,用标签引物-套式/多重PCR技术检出间日疟原虫阳性6例,镜检初检出10例间日疟原虫阳性,经复查血片后有4例排除了疟疾感染。镜检复核阳性的6例样本PCR均为阳性。以镜检复核为标准,两法阳性和阴性符合率为100%。结论标签引物-套式/多重PCR检测疟疾感染具高度敏感性和特异性,对疟疾鉴别诊断和明确诊断具有重要价值。

应用巢式PCR检测实验小鼠组织中申克孢子丝菌

目的研究实验小鼠申克孢子丝菌感染的分子生物学鉴定方法,为建立检测人申克孢子丝菌感染的快速、敏感、特异方法提供依据。方法建立申克孢子丝菌感染小鼠模型,应用合成的申克孢子丝菌种特异性引物ITS3-SSP进行巢式PCR扩增小鼠皮损组织内核糖体DNA的ITS2靶序列,将检测结果与标准形态学鉴定结果对比,观察种特异性引物PCR扩增结果的准确程度、敏感性和特异性。结果组织学检查可以从11只感染小鼠尾组织中见到染成紫红色的圆形、卵圆形孢子;第一循环PCR检测实验小鼠申克孢子丝菌,只有3只小鼠呈阳性;而巢式PCR检测申克孢子丝菌特异性DNA,11只实验小鼠中9只呈阳性;而3只对照组小鼠无一呈阳性。结论本实验结果说明巢式PCR结合种特异性引物ITS3-SSP可以有效检出实验小鼠皮损中的申克孢子丝菌,具有一定的敏感性和特异性,尤其是对于组织学检查和真菌培养阴性的标本,本方法是一个很有潜力的替代方法。

逆转录—聚合酶链反应在HIV-1感染诊断中的应用

[目的 ]评价逆转录 -聚合酶链反应 (RT PCR)在HIV 1感染诊断中的应用。[方法 ]采用RNA一步法试剂盒提取RNA。用 3套分别来自于LTR gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。[结果 ]对 2 4例血清标本进行检测 ,其中 15例为HIV感染者 ;1例为免疫印迹试验可疑待确定 ,但经过 1年的随访可排除 ;另外 8例为正常者。经过巢式扩增 ,15份阳性标本中有 14份扩增出两条或两条以上核酸片段 ,1份未扩增出任何一条片段 ,其敏感性达93 3 % ( 14 /15 )。其中 6份肝素抗凝标本env区域均未扩增出片段。阴性标本无片段 ,其特异性为 10 0 % ( 8/8)。[结论 ]RT PCR具有高敏感性和特异性 ,可用于窗口期HIV感染的诊断及HIV 1阳性母亲所生婴儿的HIV检测 ,可作为免疫印迹试验的补充和辅助诊断。

HIV-1结构基因多重巢式RT-PCR方法检测

目的建立一种简便、可靠的可用于诊断人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的多重巢式逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法。方法针对广西壮族自治区HIV-1主要流行毒株pol、gag和env基因区设计PCR引物,建立同时扩增3个基因的多重巢式RT-PCR方法,检测118例HIV-1阳性样本和48例HIV-1阴性样本,并与免疫印迹法检测结果比较,对多重巢式PCR方法进行评价。结果多重巢式RT-PCR方法的检测下限为250 copies/mL,灵敏度和特异度分别为96.6%,97.9%,重复性为98.3%,与免疫印迹法的一致性为97.6%。结论本研究建立的多重巢式RT-PCR检测方法具有高灵敏度、高特异度、重复性好、快速等优点,可作为一种快速、简便、可靠的HIV-1感染辅助诊断方法。

阿德福韦酯抗病毒治疗1a后乙肝病毒基因型变化情况的观察

观察阿德福韦酯抗病毒治疗1 a后慢性乙肝患者体内HBV基因型变化情况。随机选择152例慢性乙肝患者作为研究对象,其中52例患者作为抗病毒治疗组,口服阿德福韦酯进行抗病毒治疗,另外100例患者作为对照组,口服护肝片进行护肝治疗,2组病人治疗周期均为1 a,分别在用药后第3、6、12个月进行随访,随访内容包括患者的依从性和不良反应、HBeAg/HBeAb、肝功能、HBV DNA定量检测,并采用多对型特异性引物巢式PCR基因分型技术动态监测治疗期间HBV基因型的变化情况。治疗1 a后,抗病毒治疗组中有1例患者体内HBV基因型发生改变,由治疗前的B型变为B/C混合型,并且病情出现反弹和加重。对照组未发现HBV基因型改变。2组HBV基因型变化率(1.9%和0%)之间没有显著性差异(P>0.05)。慢性乙肝患者体内HBV基因型可发生改变,而且1 a内即可发生,抗病毒治疗可能是促进HBV基因型改变的相关因素。HBV基因型转变可导致患者病情反弹和加重。

应用特异性引物鉴定人申克孢子丝菌感染

目的研究人申克孢子丝菌感染的分子生物学鉴定方法,为建立检测人申克孢子丝菌感染的快速、敏感、特异方法提供参考资料。方法从疑似申克孢子丝菌感染患者的感染部位表面刮取物、腐烂组织或活检组织中提取DNA,应用合成的申克孢子丝菌特异性引物ITS3-SSP进行核糖体DNA内ITS2靶序列PCR扩增,将检测结果与真菌培养鉴定结果或组织病理学检查对比,观察种特异性引物PCR扩增结果的敏感性和特异性。结果在17例经形态学检查和/或真菌培养检查证实的组织标本中,有12例扩增出191 bp的片段,其中7例组织中发现染成紫红色的圆形或卵圆形的孢子;而在11例经真菌培养证实为申克孢子丝菌的标本中,有4例样品巢式PCR结果为阴性。结论应用所设计的特异性引物ITS3-SSP结合巢式PCR方法鉴定申克孢子丝菌特异、敏感,是一种非常有发展潜力的检查手段。

多引物嵌套式聚合酶链反应在艾滋病病毒感染诊断中的应用

目的 评价多引物嵌套式聚合酶链反应(Nested-PCR)在艾滋病病毒(HIV)感染诊断中的应用。方法 采用柱离心式小量组织/细胞基因组脱氧核糖核酸(DNA)抽提试剂盒提取DNA。用3套分别来自于长末湍重复序列(LTR)-gag、pol、env不同区域的序列引物进行嵌套式PCR扩增。结果 用多引物嵌套式PCR对28例不同来源标本进行检测,其中13例为HIV感染者,4例为HIV可疑感染者,4例为人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)感染者且HIV抗体检测为阴性,7例为正常者。经过检测每一套引物均漏检了1份标本,即每一套引物敏感性均为92.3％。HTLV标本经检测均为HIV阴性。根据判断标准,该检测方法敏感性和特异性均达到100％,最低检测线达到103外周血单核细胞(PBMC)。结论 多引物嵌套式PCR具有高敏感性及特异性,在鉴定HTV感染方面有重要的意义.可作为蛋白印迹试验的补充和辅助诊断。