小鼠微小病毒(MVM)荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠微小病毒(MVM)荧光定量PCR方法,并初步应用于实验小鼠中。方法根据NCBI上发表的MVM(NC_001510)基因组序列,设计引物和探针,建立MVM荧光定量PCR方法。考察引物探针的最佳线形范围,特异性及灵敏度,并使用该方法对178份清洁级小鼠粪便DNA样本进行检测。结果 MVM荧光定量PCR方法最佳线性范围为10~9~10~4拷贝/μL,标准曲线的线性关系良好,R^2值可达0.99,灵敏度为101拷贝/μL,特异性强,与大鼠细小病毒H-1株和KRV株、猪细小病毒均无交叉反应。应用荧光定量PCR方法对178份小鼠粪便DNA进行检测,结果均为阴性。结论建立的MVM荧光定量PCR方法具有特异、灵敏的特点,为MVM的流行病学调查、检测提供了有效的技术支持。

两种细小病毒MVM宿主细胞的比较研究

ＭＶＭ属自主性细小病毒，对相当多种类的体内外生长的肿瘤细胞和转化细胞有抑制作用。本文对ＮＢＫ细胞的软琼脂克隆形成率和染色体进行了分析，确认ＮＢＫ细胞为转化细胞，且对ＭＶＭ敏感。在此基础上，比较了两种细小病毒ＭＶＭ宿主细胞ＮＢＫ和Ａ＿９的细胞存活率、单位体积培养液中的细胞产量和病毒产量，认为Ａ＿９细胞更适合于作为细小病毒ＭＶＭ的宿主细胞进行病毒的制备和生产。

实验小鼠细小病毒(MMV)抗体的实验室检测能力验证结果评价

目的通过实验小鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)抗体检测能力验证实施计划,了解我国实验动物检测机构的检验能力,促进实验动物质量检测水平的提高。方法按照CNAS批准的能力验证方案,血清经过标定后,经过稳定性和均匀性等检验合格,作为能力验证样本。对血清样本采用随机编号形式发放给能力验证参加单位,并附作业指导书。本次能力验证为定性检测,检测方法采用ELISA方法。要求参加单位在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,满意结果为样品的检测结果与预检结果一致,不满意结果为样品检测结果与预检结果不一致或参加单位未反馈结果。结果样本血清均匀性试验和稳定性试验结果显示,样本均符合能力验证样本均匀性和稳定性要求。本次能力验证共有19个省市的33个实验动物检测机构报名参加。33个检测机构均提交了满意结果,满意度为100%。结论实施此次能力验证计划能够反映我国实验动物检测实验室的检测能力和水平,我国实验动物质量检测机构对实验小鼠细小病毒(MMV)抗体检测的能力较高。

响应面法优化鼠细小病毒悬液制备及滴度测定

[目的]研究鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,同时制备高滴度的MMV。[方法]通过Box-Behnken设计-响应面法优化A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。[结果]A9细胞的最佳接种浓度、病毒培养时间及病毒吸附时间分别为9×10^(3)个/孔、12 d及0 h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为0.5时,感染后72 h收获,病毒滴度最高。[结论]Box-Behnken设计-响应面法适用于A9细胞制备MMV及MMV感染性滴度测定工艺。制备的病毒液的平均滴度为6.35TCID_(50)/0.1 mL。

重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用

目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108～1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%～30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%～50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。

鼠细小病毒感染性滴度测定方法的建立及病毒制备

目的建立鼠细小病毒(MMV)感染性滴度测定方法,并制备高滴度的MMV,为生物制品病毒清除/灭活工艺的验证奠定基础。方法通过分析NB324K细胞接种量、培养时间及病毒吸附时间等参数,建立MMV病毒滴度测定的半数细胞感染剂量法(CCID5)0,并分析其精密性;以A9细胞制备MMV,分析感染复数(MOI)、收获时间及收获样本对病毒滴度的影响,并检测病毒的稳定性。结果NB324K细胞的最佳接种浓度、培养时间及病毒吸附时间分别为5×103个/孔、48h及2h,所建立的检测方法精密性较好;A9细胞沉淀中病毒滴度高于上清,且随病毒MOI值的升高而逐渐增加,在MOI为10时,感染后48h收获,病毒滴度最高。制备的病毒液的平均滴度为8.69CCID50/ml,4℃和37℃保存7d及反复冻融5次,稳定性良好。结论已建立了MMV感染性滴度测定方法,并制备了高滴度的病毒,为以MMV为指示病毒进行病毒清除/灭活工艺验证奠定了基础。

儿童声带息肉的病理形态改变与人类乳头瘤病毒的相关性

目的探讨儿童声带息肉组织的形成病因及发生发展机制。方法收集39例儿童声带息肉组织(试验组)及9例尸检正常声带组织中的上皮组织(对照组),测量其上皮厚度与上皮下Reinke′s间隙厚度。运用原位杂交方法检测2组人类乳头瘤病毒(HPV)6/11 DNA,免疫组织化学方法检测其P63、鼠双微基因2(MDM2)蛋白的表达。结果试验组声带息肉组织中,上皮无角化者19例,角化不全者11例,完全角化者9例;上皮呈内生型生长者15例,呈外生型生长者10例,呈混合型生长者14例。试验组上皮厚度最高值及平均值、Reinke′s间隙厚度分别为(601.03±229.99)μm、(390.43±158.36)μm、(28.07±14.00)μm,HPV6/11 DNA的阳性表达率为48.72%,P63、MDM2蛋白的阳性表达值分别是33.62±16.91、153.93±11.59。对照组上皮厚度的最高值和平均值、Reinke′s间隙厚度分别为(152.95±16.17)μm、(135.30±24.04)μm、(11.26±2.66)μm,HPV6/11 DNA的阳性表达率为14.29%,P63、MDM2蛋白的阳性表达值分别是8.75±4.57、163.73±6.01。试验组各项指标与对照组比较,差异均有统计学意义(Pa<0.01,0.05)。HPV6/11的阳性表达与儿童声带息肉上皮组织的最高厚度、平均厚度均呈正相关(r=0.583、0.520,Pa<0.05)。结论 HPV6/11感染是儿童声带息肉形成的重要原因之一。P63、MDM2在儿童声带息肉形成过程中发挥重要作用。

小鼠微小病毒Q-PCR检测方法在病毒去除工艺验证中的应用

目的将小鼠微小病毒(murine minute virus,MVM)Q-PCR检测方法应用于病毒去除工艺验证中。方法使用MVM Q-PCR法和细胞病变法同时检测10倍系列稀释后的MVM,建立核酸拷贝数与病毒滴度之间的函数关系,并应用于纳米膜过滤和层析病毒去除工艺验证中。结果核酸拷贝数与病毒滴度间呈线性关系,R^2可达0.9863。应用于纳米膜过滤去除工艺验证,两种方法检测结果具有一致性;应用于层析去除工艺验证,两种方法在亲和层析、阴离子柱层析、阴离子Q膜层析工艺中结果具有一致性,但在具有灭活病毒的疏水层析中,结果不一致。结论在病毒去除工艺验证中,MVM Q-PCR法可作为现有细胞病变法的补充。

鼠细小病毒质量对除病毒过滤验证的影响

目的探讨鼠细小病毒(murine minute virus,MVM)质量对于除病毒膜过滤验证的影响。方法利用病毒浓缩试剂盒和Sartobind Q离子交换膜在不同条件下对MVM进行两步纯化。采用滤器Virosart HF和Viresolve®Pro Micro Device,使用纯化的MVM进行2种抗体的纳米膜过滤除病毒验证。结果在2种抗体的纳米膜过滤除病毒过程中,加入两步纯化MVM的样品与未加毒的样品相比通量衰减分别仅从9%增至12%和23%,而加入仅经过病毒浓缩试剂盒纯化的MVM分别从9%增至26%和55%。结论MVM纯度的提高可改善除病毒过滤验证中的通量衰减。