香蕉红素氧还蛋白酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

结合改良的BDSMARTTMPCRcDNASynthesisKitUserManualcDNA合成试剂盒，反转录合成带有目的接头cDNA第一链．通过LD—PCR，扩增双链cDNA（dscDNA）．产物经双酶切后回收，与经同样双酶切的酵母双杂交系统中pGADT7载体连接转化，并进行了鉴定．结果表明：提取的RAN的A200／A200=1．82，表明所提RNA纯度高；双链cDNA文库大于0．2kb，且弥散较长，成瀑布条带状；根据生长菌落计数，文库舍有1．2×10^6转化子。重组子不同插入片段在0．3—2kh之间。表明该文库达到建库要求，为下一步进行酵母双杂交试验奠定基础．此方法用于构建cDNA文库与酵母双杂交系统相结合的研究目前尚未见过相关报道．

香蕉红素氧还蛋白基因在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD,并在其上下游分别引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位点,双酶切后与同样经NdeⅠ和SalⅠ双酶切的诱饵质粒载体pGBKT7连接,构建重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并将此两重组诱饵质粒转入酵母菌株AH109中进行营养缺陷型分析检测毒性及自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明此两个重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为从香蕉叶片cDNA文库中筛选获得与香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD相互作用的受体蛋白基因奠定了基础。