一种新型家蝇幼虫抗菌肽基因(MDAP-2)的真核表达及抑菌活性检测

利用毕赤酵母表达系统表达新型家蝇抗菌肽MDAP-2基因(Musca domestica antimicrobial peptide,MDAP-2),为其作为新型抗菌物质应用于临床提供实验依据。根据已有的MDAP-2的氨基酸序列,采用PCR技术扩增获得MDAP-2基因,构建真核重组表达质粒pPIC9K-MDAP-2,将线性化的重组质粒电击转入毕赤酵母(P.pastoris)感受态GS115细胞内,将PCR鉴定为阳性的重组酵母菌进行甲醇诱导表达,并采用Tricine-SDS-PGAE检测表达产物的大小,经镍柱亲和层析纯化获得纯度较高的重组蛋白,采用管碟法检测重组蛋白的生物学活性。结果显示,重组质粒pPIC9K-MDAP-2获得高效表达,蛋白分子量为7.8 kD,管碟法检测重组蛋白对大肠杆菌与沙门氏菌均具有体外抑菌活性。MDAP-2基因的成功表达为进一步研究表达产物的生物学及免疫学活性奠定基础。

Spinosyn A对家蝇生长发育及Na^+,K^+-ATPase、Ca^(2+),Mg^(2+)-ATPase和AChE的影响

研究了Spinosyn A对家蝇(Musca domestica L.)生长发育及其Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase和AChE的影响。结果表明,SpinosynA对家蝇有杀卵作用,且其化蛹率显著下降;SpinosynA在离体时低浓度抑制家蝇头部Na+,K+-ATPase活性而高浓度酶被激活,活体时在48h内酶活性都受到明显抑制,并随浓度升高而增强;离体时低浓度抑制家蝇Ca2+,Mg2+-ATPase活性而高浓度时酶被激活;活体时24h后该酶被激活。离体时对家蝇头部AChE有弱的抑制作用,但不同处理浓度之间无差异,而在活体时48h内能显著激活AChE活性。

响应面法优化家蝇幼虫中抗氧化成分的提取工艺

以家蝇幼虫为原料,以1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除率为指标,采用响应面法对其抗氧化成分的提取工艺进行优化.在单因素试验的基础上,采用全因子试验的方法,分别对提取条件中的甲醇体积分数、温度、时间三因素进行研究;通过二次回归方程解得出最佳配比为甲醇体积分数为36%,提取时间为4.8h,提取温度为18℃。经试验表明,在此条件下提取液对1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除率为81.9%,与理论值接近.

家蝇几丁质酶基因MDcht2的原核表达及其表达产物的酶学性质分析

几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统获得高纯度的MDCht2重组蛋白,并从几丁质酶活性及抗菌活性两方面来初步探讨MDCht2的生物学功能。MDCht2的cDNA序列设计包含酶切位点Eco RⅠ、HindⅢ和6×His标签的引物,以家蝇3龄幼虫的cDNA为模板进行PCR扩增,以pET28a(+)为载体构建重组质粒,并转化到大肠杆菌Transetta (DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,利用Ni离子亲和层析技术纯化MDCht2重组蛋白,Western Blot技术及质谱分析鉴定纯化蛋白。以4MU-(GlcNAc)3为底物,测定重组蛋白的酶活性;采用微量液体稀释法分析重组蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母菌的抗菌活性。成功克隆MDCht2基因,构建了具有正确序列的原核重组表达质粒,将重组质粒导入Transetta(DE3)中,经镍柱纯化获得带His标签的重组MDCht2蛋白,质谱分析显示重组蛋白与MDCht2蛋白序列一致。酶活分析表明,不同浓度的MDCht2重组酶均有几丁质酶活性,呈现一定的量效关系;该重组蛋白的最适pH值为4.0,在pH=8.0时稳定性最好;最适温度为35℃;金属离子和Tris对MDCht2酶活均有抑制作用。抗菌活性结果显示,MDCht2蛋白对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌均无抑菌效果,但对白假丝酵母菌有抑制作用,MIC值为225μg/m L,MBC(Minimum bactericidal concentration)值为450μg/mL。本研究成功获得了MDCht 2重组蛋白,体外检测有较强的几丁质酶活性和抗真菌活性,为进一步研究该酶的功能奠定一定基础。