家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1的分子特性分析及其抗真菌作用

制备家蝇Musca domestica幼虫血淋巴中的抗真菌肽,对其分子特性及抗真菌机制进行研究。通过C18柱固相萃取、反相高效液相色谱相结合的方法,成功制备到家蝇幼虫血淋巴抗真菌肽MAF-1。SDS-PAGE分析结果表明,MAF-1的分子量为17.136kDa。通过圆二色谱测出水溶液中MAF-1主要以α螺旋及β折叠为主。扫描电镜观察结果显示,MAF-1作用白假丝酵母菌Candida albicans1h后,部分真菌出现表面凸凹不平,细胞结构模糊;随着作用时间的延长,表面形成很明显的凹陷,皱缩,个别菌体破裂,内容物外泄,病变真菌发生率高于对照组。单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)结果显示,正常对照组的真菌呈现典型的圆形,而实验组则出现明显的拖尾现象即形成"彗星"样细胞特征,细胞迁移距离明显高于对照组。SDS-PAGE图谱显示,MAF-1作用后的白假丝酵母菌菌体蛋白谱带一些条带明显变浅,条带数下降,甚至消失。结果提示MAF-1可能具有独特的抗真菌机制。

家蝇抗真菌肽-溶菌酶基因的克隆、表达及序列分析

旨在对家蝇抗真菌肽MAF-1-溶菌酶(LZM)基因进行生物信息学分析,并进行融合基因MAF-1-LMZ的克隆和表达分析。从Gen Bank获得家蝇抗真菌肽MAF-1和溶菌酶LZM的编码序列,分析和预测这两种蛋白质的结构和功能。PCR扩增融合蛋白质抗真菌肽-溶菌酶的基因MAF-1-LMZ,将其克隆到原核表达载体p ET-28a中,重组质粒p ET-28a-MAF-1-LMZ在大肠杆菌Origmi B/DE3中经用IPTG诱导表达,表达产物MAF-1-LMZ通过SDS-PAGE电泳进行鉴定,采用小试管法倍比稀释法进行活性验证。结果显示,融合蛋白质MAF-1-LMZ序列的ORF为969 bp,编码322个氨基酸残基,理论分子量为35 468.6 Da,等电点为8.31,在大肠杆菌Origmi B/DE3中得到成功表达。其纯化后的目的蛋白具有抗真菌活性。