雏番鸭细小病毒病的病毒分离和鉴定

从以腹泻和呼吸困难为主要症状的雏番鸭肝、脾中分离到2株番鸭细小病毒(Muscovy Duckling Parvovirus,MPV)MPV-F和MPV-P。番鸭胚胎接种病毒后8～7天死亡,胚体呈弥漫性充血、出血。病毒能在番鸭胚肾(MDEK)细胞和番鸭胚成纤维(MDEF)细胞上增殖。雏番鸭人工感染病毒后出现与自然罹病者相似的症状,并回收到病毒。小鹅和雏半番鸭接种病毒后不出现临床症状。病毒耐乙醚、胰蛋白酶、酸和热。但是,对紫外线照射敏感。在电镜下病毒呈晶格排列,有实心和空心两种病毒粒子,直径为20～24nm,无囊膜。有4种结构蛋白;VP1(85kD)、VP2(70kD),VP3(56kD)和VP4(39kD),其中VP3是主要结构蛋白。病毒核酸为单链DNA,分子量约为5.1kb。酶联免疫吸附试验(ELISA),荧光抗体试验(FA)、胶乳凝集(LPA)试验、琼脂扩散沉淀(AGP)试验和中和试验(NT)中,MPV的单抗与鹅细小病毒(Gosling Parvovirus,GPV)不发生交叉反应,GPV单抗也不与MPV发生反应。证明MPV是雏番鸭以泻、喘为主要症状的疫病的病原,是细小病毒科的一个新成员。

番鸭小鹅瘟病毒的分离与鉴定

从临床表现腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为特征的发病雏番鸭肝、脾中分离到2株病毒(命名为GPV-PT株和GPV-F株),分离株在间接免疫荧光抗体试验(IFA)和琼脂扩散沉淀(AGP)试验中只与GPV单抗反应,与MPV、NDV、IBDV单抗和DHV阳性血清均不发生反应;电镜观察见到实心和空心两种粒子,无囊膜,圆形,呈立体对称,直径20～24 nm;分离株无血凝活性;对紫外线和胰蛋白酶均不敏感;对番鸭胚的ELD50为lg6.5;雏番鸭人工感染病毒后出现与自然病例相似的症状,并回收到病毒。上述结果表明分离的2株病毒均为番鸭小鹅瘟病毒。

新型番鸭细小病毒的发现及其感染的临床表现

2008年下半年以来,福建省、浙江省、安徽省及江苏省等地部分鸭场或养鸭户的雏半番鸭和台湾白鸭出现低病死率,约于40日龄起脚易断、上喙变短占近30%,至出栏时残次鸭达60%;免疫接种了雏番鸭细小病毒弱毒活疫苗的雏番鸭依然发生类雏番鸭"三周病",除出现死亡外,幸存鸭的番鸭翅脚易断、上喙变短,83%感染鸭成为僵鸭,对我国养鸭业造成了较大的直接经济损失。经病原学检测、病毒分离鉴定和实验室感染试验,发现其病原为与原经典的雏番鸭细小病毒(MDPV)在基因组上、感染宿主范围和致病性存在较大差异的番鸭细小病毒,鉴于此,将之暂定名为新型番鸭细小病毒(NMDPV)。

雏番鸭细小病毒病病毒分离鉴定

采集以腹泻、呼吸困难为主要症状的雏番鸭肝、脾病料 ,接种 14d龄非免疫番鸭胚 ,80 %胚在 3～ 7d死亡 ,胚体呈弥漫性充血、出血。接种番鸭胚成纤维原代细胞 72h可见细胞圆缩、聚团等变化。收集尿囊液及细胞培养物 ,以番鸭细小病毒 (Muscovyducklingparvovirus ,MDPV)阳性血清进行聚苯乙烯乳胶凝集 ,病料培养物均呈阳性反应 ,提取病料接种的尿囊液及细胞基因组DNA ,用自行设计引物PCR扩增到与设计相符的 60 0bp片段 ,经酶切鉴定 ,结果表明克隆到的片段为雏番鸭细小病毒特异性片段 。

雏番鸭细小病毒病快速诊断方法的建立

番鸭三周病、番鸭细小病毒型“白点病”以及番鸭小鹅瘟在临床上发病日龄非常相似,也是各个养鸭场经常出现的疾病,它们有时会出现混合感染或继发感染,给诊断带来了困难。针对这种情况,本文通过对三周病病原、番鸭细小病毒型“白点病”病原以及番鸭小鹅瘟病原核酸的分析比较,在三周病病原的特异性区域设计了一对特异性引物,通过PCR检测,能够快速、准确的诊断出雏番鸭细小病毒病。

雏番鸭细小病毒病研究进展

雏番鸭细小病毒病是由雏番鸭细心病毒引起幼龄番鸭的一种新的番鸭疫病。该病于1980年在中国首次报道。本病因日龄不同而异，3周龄以下的雏番鸭主要是急性感染，主要症状是喘气、厌食、腹泻、脱水、迅速消瘦、死亡率高，特征病变是胰炎、肠炎和肝炎。3周龄以上的番鸭主要是慢性感染。雏番鸭细小病毒与小鹅瘟病毒均属于细小病毒科，其理化特性和基因组结构非常相似，常规的病毒分离和血清学诊断方法不能区分雏番鸭细小病毒与小鹏瘟病毒感染。本文综述了雏番鸭细小病毒病近来在病原学、流行病学、病理学、临床诊断、预防与治疗及其分子生物学等方面的研究进展。

2012—2018年福建省部分地区番鸭临床病例细小病毒病病原检测

为初步了解福建省番鸭细小病毒病流行情况,提出相应的防控方法,2012—2018年,在福州、莆田、漳州和三明4个主要番鸭饲养区18个固定养殖场,收集435例临床病例样品,进行番鸭细小病毒病(番鸭三周病和番鸭小鹅瘟)病原检测,分析病原感染状况。结果显示:2012—2018年,在435例临床病例中,检出番鸭细小病毒病病原阳性病例155例,阳性检出率为35.6%(155/435),其中番鸭三周病阳性病例102例,番鸭小鹅瘟阳性病例125例,两种病混合感染病例72例。2012—2014年,番鸭三周病病原检出率约为40.0%,2015年降至27.4%,2016—2018年降至5.0%以下,病原检出率大幅下降(P<0.01);2012—2018年番鸭小鹅瘟病原检出率在23.4%~34.9%之间,检出率下降不明显(P>0.05)。分析认为,2014年番鸭三周病商品疫苗的推广应用大大降低了三周病的临床发病率,使该病已非导致番鸭临床发病的主要因素;而对于番鸭小鹅瘟,因缺乏针对性的有效疫苗,防控效果不明显。因此,该地应继续加强番鸭三周病活疫苗的免疫,最终净化该病;而对于番鸭小鹅瘟,需做好综合防控,可免疫鹅细小病毒弱毒疫苗,控制临床发病,减少疫病造成的损失。

应用PCR快速诊断番鸭细小病毒病和小鹅瘟

根据GenBank中已发表的番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)全序列,分别设计并合成特异性引物MDPVF/R和GPVF/R,对细小病毒属成员GPV、MDPV、犬细小病毒(CPV)及鸭常见病毒病病原如鸭瘟病毒(DPV)、鸭病毒性肝炎病毒(DHV)、鸭呼肠病毒(DRV)、流感病毒(AIV)的核酸进行PCR扩增。结果表明,引物特异性良好,引物MDPVF/R只能特异性扩增出MDPV的714 bp基因片段,引物GPVF/R只能特异性扩增出GPV的570 bp基因片段;敏感性试验结果表明,MDPV DNA最低检出量为17.5 pg,GPV DNA最低检出量为13.7 pg。该方法的建立对这两种疾病的鉴别诊断具有重要意义。

番鸭细小病毒分离鉴定

采集以腹泻、呼吸困难为主要症状的雏番鸭肝、脾病料，接种１４日龄非免疫番鸭胚，８０％胚在３－７天死亡，胚体呈弥漫性充血、出血。接种番鸭胚成纤维原代细胞７２小时可见细胞圆缩、聚团等变化。聚苯乙烯乳胶凝集试验呈阳性，提取病毒接种细胞及尿囊液 ＤＮＡ，用自行设计引物扩增到与设计相符的 ６００ｂｐ片段，克隆至 Ｔ载体，经酶切及序列分析表明我们所分离到的病毒为雏番鸭细小病毒（Ｍｕｓｃｏｖｙ Ｄｕｃｋｉｌｉｎｇ Ｐａｖｏｖｉｒｕｓ，ＭＰＶ）。

鸭新城疫病毒与番鸭细小病毒二重PCR方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)L基因和番鸭细小病毒(MDPV)Vp3基因的保守序列,采用Primer Premier 5.0软件设计并合成了2对引物。通过优化反应条件及特异性、敏感性评价,建立了能同时检测鸭源NDV和MDPV的二重PCR方法。该方法对鸭源NDV和MDPV的检测敏感性分别为30和16fg。同时使用该方法对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭圆环病毒、H9亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、沙门氏菌、大肠杆菌和禽多杀性巴氏杆菌进行检测,结果显示全为阴性。本研究建立的鸭源NDV和MDPV的二重PCR检测方法,具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于鸭源NDV和MDPV感染的快速鉴别检测。

番鸭小鹅瘟病毒感染诱导细胞自噬

旨在探讨番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)感染番鸭成纤维细胞与鸭胚胎肝间充质干细胞后对细胞自噬的影响,以及细胞自噬对病毒增殖的作用。借助激光共聚焦方法观察LC3自噬荧光颗粒,以及Western blot检测细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、磷酸化mTOR(p-mTOR)表达量以及转录因子TFEB磷酸化水平,应用自噬调节剂(雷帕霉素、3-甲基腺嘌呤与氯喹)来研究细胞自噬对病毒增殖的影响,结果显示,MDGPV感染能够促进易感细胞自噬发生,细胞自噬有利于MDGPV在易感细胞中的复制。本研究表明MDGPV感染诱导的细胞自噬对维持病毒在宿主细胞中的复制增殖过程中发挥作用。

雏番鸭细小病毒和传染性法氏囊病病毒混合感染的检测

2017年12月,广西某番鸭养殖场的鸭群出现生长缓慢,临床表现软脚,拉白色粪便的腹泻并伴有一定的神经症状等;剖检可见肝脏肿大出血、腹腔有纤维素性渗出物、肠黏膜有不同程度的充血,法氏囊萎缩等病变;于20日龄开始发病,30日龄送检时发病率20%、死亡率10%。无菌取番鸭的病变组织,分别进行番鸭细小病毒(MDPV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)的核酸特异性检测,结果均呈阳性,并成功分离到一株番鸭细小病毒(命名为MDPV GX1712)和一株传染性法氏囊病病毒(命名为GL1712);基因序列分析结果显示,分离株GX1712与GX5、P 1988、 SAASSHNH等MDPV参考株的亲缘性最近,相似性高达98.5%～99.1%,在进化树中处同一个分支,并且与疫苗株FZ91-30亲缘性相距较远,表明该分离株为MDPV野毒株;基于VP1-b序列分析IBDV分离株GL1712与中国新型超强毒株HLJ0504同属HLJ0504-like cluster,而基于vVP2序列则与中等偏强毒力参考株同属C2-intermediate IBDV genotype,为基因重排毒株。根据发病日龄、临床症状、病理剖检和实验室诊断,确诊该临床发病番鸭群混合感染了番鸭细小病毒和传染性法氏囊病病毒。