人工合成mutacin的抑菌活性研究

目的:研究人工合成mutacinⅠ和Ⅲ对牙菌斑主要致龋菌的抑制作用,寻找其活性基团。方法:通过固相合成法合成mutacinⅠ和Ⅲ及不同链长的系列短肽。采用二倍稀释法检测系列短肽对变形链球菌和血链球菌的最小抑菌浓度,并检测其对变形链球菌、血链球菌、韦荣氏菌、黏性放线菌、内氏放线菌、远缘链球菌的抑菌圈直径大小。结果:人工合成mutacinⅠ和Ⅲ及部分短肽类似物对变形链球菌、远缘链球菌、血链球菌有抑菌活性。结论:人工合成的mutacinⅠ和Ⅲ及部分短肽类似物有一定的抑菌活性,可初步确定其活性基团位置。

变形链球菌变链素粗提物活性的初步研究

目的 :测定变链菌临床株变链素粗提物的抑菌活性和热稳定性 ,为对变链素的进一步研究提供基础。方法 :用氯仿抽提 ,对其进行抗菌活性检测和热稳定性检测。结果 :10ml液体的粗提物 ,可形成直径 19mm的抑菌环 ,表明粗提物具有抗菌活性 ;将粗提物加热到 80℃ ,抗菌活性可维持 12 0min ,表明其中含有热稳定性抗菌物质。结论 :变链素的粗提物能反映变链素的活性和性质 ,适合于大量临床株的研究。

高龋菌株产生的变链素对口腔链球菌抑制活性的比较

目的通过比较高龋和无龋儿童变形链球菌临床分离株产生的变链素对口腔链球菌的抑制活性,探讨变链素的产生与其致龋性及口腔微生态的关系。方法从10例高龋儿童和10例无龋儿童牙菌斑内分离、鉴定得到80株变形链球菌临床分离株,分为高龋组和无龋组。用平板法检测两组菌株产生的变链素对口腔链球菌Streptococcusoralis ATCC10557的抑制情况,观察两组菌株产生的抑菌环大小,测量记录数据,T检验比较两组菌株抑菌环均数差异。结果高龋组产生的抑菌环平均值为10.4mm,无龋组平均值为6.9mm,T检验显示差异具有显著性(t值为3.098,P<0.05)。结论高龋菌株产生的变链素对ATCC10557有更大的抑制活性,变链素对口腔链球菌的抑制活性与其致龋力呈正相关。

变形链球菌CH43变链素Ⅰ基因片段的克隆及表达

目的:获得编码变形链球菌CH43变链素Ⅰ前体肽基因片段,并诱导其在不杀伤工程菌的前提下高效表达。方法:用PCR技术从变形链球菌CH43基因库中扩增出编码变链素Ⅰ成熟肽mutA基因片段相应大小的DNA片段,将片段与pMD18 T载体连接后测序。将测序正确的mutA按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pProEX,将连接产物转化入E.coliDH5α,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白。以IPTG浓度、A600值、诱导时间各梯度优化表达。结果:PCR获得的mutA序列与GenBank报道的一致(为147bp)。优化了诱导条件使重组载体在E.coliDH5α中高效表达,融合蛋白经SDS PAGE,在相对分子质量为5. 7×103处有特异的蛋白条带,在A600为1. 666时,加入IPTG至终浓度为1. 0mmol/L,诱导6h,目的蛋白表达量最高,占菌体总蛋白量的20%左右。结论:成功克隆变形链球菌CH43变链素ⅠmutA基因片段,并在E.coliDH5α中高效表达。

MS临床株变链素抑菌活性检测和相关基因的PCR分析

目的:对MS临床株产生变链素的抑菌活性进行检测并分析已知变链素的结构基因在MS临床株中的分布情况,为筛选新变链素产生株提供信息。方法:选择20例成年个体的100株MS,首先用平板法检测MS菌株产生的变链素对10个指示株产生的抑菌环大小和抑菌谱的多少,再用PCR方法扩增3种不同变链素结构基因的序列,观察有无扩增。结果:所有的实验株(100%)均可产生抑制6～8个指示株的变链素,抑菌环和抑菌谱在不同个体之间变异。PCR扩增mutAI基因的阳性率为26%,对mutAII和mutAIII的PCR扩增均未见扩增产物。结论:MS临床株均可产生变链素,但已知变链素的结构基因在其中的分布率低,提示可能有未知变链素的存在。

变链素的纯化

目的从变异链球菌临床株中分离纯化变链素,为进一步从分子水平研究变链素奠定基础。方法通过抑菌活性检测,从变异链球菌临床株中选择出抑菌活性较强的菌株。用氯仿抽提法从该菌株培养液中粗提变链素,经固相萃取和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对粗提物进行纯化。结果获得变链素活性较强的菌株1G。从其200 mL液体培养基中粗提出变链素约15μg,经固相萃取柱洗脱,再经过RP-HPLC的2次纯化,得到有抑菌活性的成分,此为纯化的变链素。结论变链素相对分子质量小,分离提纯步骤复杂,本实验得到纯化的变链素,为下一步研究变链素的氨基酸序列和基因序列奠定了基础。

变链素活性与变形链球菌基因多态性的关系研究

目的探讨变链素的活性与变形链球菌（MS）基因多态性的关系。方法在AP-PCR基因分型的基础上,选择来自单基因型定植的个体50株MS为单基因型组,另50株来自多基因型共同定植的个体为多基因型组,用平板法检测2组菌株产生变链素对10个指示株的抑制情况,T-检验比较2组菌株抑菌环和抑菌谱的均数差异。结果所有的实验株（100%）均可产生抑制6-8个指示株的变链素,抑菌环和抑菌谱在不同个体之间变异,组间均数的比较不具有显著性（P值分别是0.12,1.79）。结论多基因型MS定植的口腔,在产生变链素方面似乎不具有优势。

变异链球菌sepM基因中存在与变链素IV形成相关的突变类型

目的了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征;探索sepM基因突变与变异链球菌变链素IV形成能力的关系。方法采用抑菌圈法检测80株变异链球菌临床株的变链素IV形成能力,根据核心基因组多位点序列分型方法构建这80株变异链球菌临床株的最小生成树,根据最大似然法构建这80个样本的进化树。采用GeneMarkS软件预测这些菌株的编码基因,并将预测到的基因与参考基因组UA159的sepM基因序列进行比对,了解sepM基因在变异链球菌临床株中的突变类型及其分布特征。通过分析变链素IV形成组和无变链素IV形成组菌株中差异分布的突变类型及比较突变组和无突变组菌株中抑菌圈的大小,明确与变链素IV形成相关的突变类型。结果 80株变异链球菌临床株中有变链素IV形成(变链素IV形成组)和无变链素IV形成(无变链素IV形成组)的菌株各25和55株。最小生成树结果提示变链素IV形成组菌株之间的等位基因差异少于变链素IV形成组和无变链素形成组组间菌株,并且变链素IV形成组菌株间起源类似。80株变异链球菌临床株中共检测到34个单碱基突变位点,其中有4个碱基突变(C31T、G533A、C756T、C1036T)在组间存在差异(P分别为0.001、<0.001、0.025及0.003)。这些差异分布的突变均与变链素IV的形成呈正相关。结论变异链球菌临床株sepM基因中存在与变链素IV形成相关的突变类型。

变异链球菌密度感应系统调控变链素的研究进展

密度感应是指细菌根据菌群密度的变化分泌和感应信号分子-感受态调节肽(CSP),调控相关基因的表达。变链素是变异链球菌合成分泌的抗菌性多肽,在菌群中可调节相关细菌的生物学行为。变异链球菌密度感应系统可调控变链素的合成和分泌,参与菌群间的交流,调控牙菌斑生物膜的稳定性。下面就近年来受密度感应系统调控的变链素的研究进展作一综述。

含尿素酶基因的重组变链菌JH1140变链素对变链菌UA159的抑制作用

目的:检测重组变形链球菌JH1140的变链素抑制其他变形链球菌(变形链球菌UA159)的效果。方法:以变形链球菌UA159为指示菌,选取野生型变形链球菌JH1140和重组变形链球菌JH1140(各20例)与变形链球菌UA159共同培养,观察记录抑菌环直径。采用SAS9.1软件包进行方差分析,比较2种细菌的抑菌环直径,分析抑菌能力。以不同浓度变形链球菌UA159为指示菌,取野生型变形链球菌JH1140和重组变形链球菌JH1140(各20例)与变形链球菌UA159共同培养,观察记录抑菌环直径。采用SAS9.1软件包进行方差分析,比较不同浓度指示菌条件下,重组变形链球菌JH1140的抑菌环直径。结果:相同指示菌浓度下,野生型变形链球菌与重组变形链球菌的抑菌环直径之间未见显著差别,P>0.05。不同浓度指示菌条件下,重组变形链球菌JH1140的抑菌环直径未见显著差别,P>0.05。结论:重组重组变形链球菌JH1140与野生型变形链球菌JH1140相比,抑菌能力未见改变。重组细菌在表达新基因的同时,其变链素分泌未受影响。

Srn821798在变异链球菌变链素Ⅳ形成中的作用

目的分析srn821798对变链素Ⅳ的影响,探索变链素Ⅳ转录后的规律。方法用靶基因预测软件RNAhybrid、RNAPredator和IntaRNA对srn821798进行靶基因预测,继而采用抑菌圈实验筛选了高表达变链素Ⅳ的变异链球菌菌株和不表达变链素Ⅳ的变异链球菌菌株各10株,并采用qPCR技术检测了这些菌株中srn821798和候选靶基因的表达水平。体外合成srn821798模拟物和抑制剂,采用电转化的方法在变异链球菌UA159标准株中构建了srn821798高表达株和低表达株,分析和比较这些菌株中srn821798和候选靶基因的表达水平。最后通过电泳和双荧光素酶报告基因实验检测了srn821798和候选靶基因sepM预测作用位点的结合能力。采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析。结果变异链球菌临床菌株中高表达变链素Ⅳ组中的候选靶基因sepM,comD,comE,nlmA及nlmB的表达水平均显著高于无表达变链素Ⅳ组,而高表达变链素Ⅳ组srn821798的表达水平显著低于无表达变链素Ⅳ组(P<0.05)。虽然标准株中srn821798上调组和下调组中候选靶基因的表达水平差异不大,但sepM的表达水平存在差异分布的趋势,并且预测的srn821798与sepM作用位点的结合能力较高。结论srn821798可能在变链素Ⅳ的形成中起着一定的调控作用,但机制有待进一步探索。

密度感应相关性变链素及其作用分析

细菌素是由某些细菌在代谢过程中产生的一类具有抗菌活性的蛋白质或多肽,变异链球菌产生的细菌素称为变链素。变链素可能与口腔生物膜中变异链球菌的致龋性及其在牙面的定植有关。目前已有多种变链素被分离、纯化并完成了基因序列和氨基酸序列的测定,变链素与密度感应调控系统的关系及在新型抗菌制剂研发中的应用价值已受到人们关注。本文就密度感应相关变链素及其作用的研究现状作一综述。

液体培养基中天然变链素的纯化

目的从变形链球菌临床株的液体培养基中分离纯化变链素,为进一步从分子水平研究变链素奠定基础。方法通过抑菌活性检测,从变链临床株中选择出抑菌活性较强的菌株。用氯仿抽提法从该菌株的培养液中粗提变链素,经固相萃取和反相高效液相色谱(RP-HPLC)对粗提物进行纯化。结果获得变链素活性较强的菌株"1G"。从其200ml液体培养基中粗提出变链素约15μg,经固相萃取柱洗脱,再经过RP-HPLC2次纯化,得到有抑菌活性的成分,此为纯化的变链素。结论变链素分子量小,分离提纯步骤复杂,本实验得到纯化的变链素,为下一步研究变链素的氨基酸序列和基因序列奠定了基础。

变形链球菌细菌素免疫蛋白作用及其与密度感应关系的研究进展

细菌素免疫蛋白是细菌为避免受到抗菌剂的影响和自身分泌抗菌多肽抑制所产生的保护性蛋白分子。变形链球菌产生的细菌素称为变链素,是一类具有抗菌活性的多肽。变形链球菌合成的细菌素免疫蛋白和变链素两者间产生协同作用,是细菌耐药性提高和抗药性出现的原因之一,使其能更好地在复杂的口腔环境中生存。本文就变形链球菌细菌素免疫蛋白的研究进展作一综述。