仿突变生物合成调控对土曲霉C23-3次生代谢产物的影响

【目的】丁内酯I是土曲霉(Aspergillus terreus)产生的一种具有多样生物活性的小分子天然产物,对其结构多样性拓展的探索具有重要意义。以一株高产丁内酯I的海洋来源土曲霉C23-3作为基础菌株,研究丁内酯前体小分子类似物和前体合成酶抑制剂对其次生代谢的影响。【方法】以海水马铃薯液体培养基为基础培养基,以3种前体小分子类似物和3种对羟基苯丙酮酸的合成酶抑制剂作为化学诱导剂,在静置发酵条件下进行菌株的化学调控培养。采用高效液相色谱、高效液相色谱-离子阱质谱联用及基于质谱的分子网络和数据库挖掘分析次生代谢产物的产量和多样性。【结果】多数前体小分子类似物和合成酶抑制剂对丁内酯I产量均有不同程度抑制,而高浓度的前体小分子类似物3,4-二羟基苯丙酮酸、两种合成酶抑制剂联用及这三者的联用表现出了较强的抑制效果;并且在丁内酯I的合成受到强烈抑制条件下,丁内酯类、土震素类、洛伐他汀类等多类次生代谢产物的合成也下降,但一种环肽类化合物产量超过10倍的大幅提升,可能是菌体对作为群体感应信号及全局性转录因子lae A诱导子的丁内酯I合成受到压制胁迫的一种应激反应,具体机制有待深入研究。【结论】丁内酯I的前体确为对羟基苯丙酮酸,3,4-二羟基苯丙酮酸及对羟基苯丙酮酸合成酶抑制剂可用作抑制丁内酯I合成的小分子工具,以用于仿突变生物合成的进一步探索以获得多样化丁内酯衍生物,也可诱导产生环肽类化合物。

黄曲霉毒素的生物合成、代谢和毒性研究进展

食品中黄曲霉毒素污染是最近关注的热点,这些毒素侵染农产品会带来很大经济损失。黄曲霉毒素有非常高的肝毒性、肝致肿瘤性、致畸和致突变性,可在采前、采中和采后的各种环境下侵染多种重要农产品,例如花生、玉米、水稻和棉籽。自然界中黄曲霉毒素的产生取决于多种因素,例如碳、氮、温度、水分活度、pH值、发育阶段、氧化胁迫、植物代谢产物。黄曲霉毒素可引起多种疾病,但是可以通过阻断和干扰吸收及干扰代谢酶来调节体内的黄曲霉毒素。本文概述黄曲霉毒素的生物合成、侵染、运输、代谢和毒性。研究它的生物合成、毒性机制、结构与功能关系和代谢运输途径,为制定有效控制黄曲霉毒素的措施提供更加深入的见解。

那西肽产生菌Streptomyces actuosus的诱变

本文介绍了亚硝基胍(NTG)、溴乙锭(EB)、紫外线(UV)和吖啶类染料等各类诱变剂对含硫多肽类抗生素那西肽产生菌的诱变,其中吖啶类染料的诱变作用最强,突变率可达0.4％以上。本文也比较了发芽孢子和原生质体的诱变,结果显示了两个材料的突变率比较接近。通过对1万余株诱变后菌株的观察,本研究共获得15株负变株。3株正变株和4株营养缺陷型。这些突变株将作为进一步研究的材料和手段。

生物法合成5-氨基乙酰丙酸的研究进展

对国内外生物法合成5-氨基乙酰丙酸(ALA)的进展进行综述,重点比较了诱变育种法和代谢工程技术在ALA生物合成研究中的应用,揭示了新兴的代谢工程技术在ALA的生产开发中极具应用前景,为生物法合成ALA的进一步发展指明了方向,有利于促进ALA生物合成的产业化。

防治畜类寄生线虫的又一阿维菌素类化合物——道拉菌素

道拉菌素是利用生物突变合成方法得到的新型阿维菌素族广谱抗寄生虫药。它的化学结构和作用机制与依维菌素相似。试验证实道拉菌素在低剂量下对多种体内外寄生虫具有良好的防治效果。

柔红霉素和襄樊霉素产生菌突变生物合成的研究

从柔红霉素产生菌SIPI1482和襄樊霉素产生菌SIPI80334诱变获得了阻断突变株SIPI1482-NS-4和SIPI80334-U33。利用这两株突变株,以柔红霉酮和柔红霉素为底物,获得了13-S-双氢柔红霉酮、13-R-双氢柔红霉酮、13-双氢柔红霉素、N-乙酰-柔红霉素和N-乙酰-13-双氢柔红霉素等转化产物。并讨论了不同属蒽环类抗生素产生菌对不同底物的转化特性等。

31-去甲氧基-他克莫司的突变生物合成

目的通过突变生物合成获得31-去甲氧基-他克莫司。方法针对大环内酯类免疫抑制剂他克莫司的聚酮链起始底物4,5-二羟基-1-烯-环己酸(DHCHC)合成酶fkbO基因,构建基因敲除载体pFIM412-fkbO并对他克莫司产生菌Streptomyces sp.FCZ-0311 fkbO基因进行框内缺失。结果获得突变株Streptomyces sp.OD14-1,经摇瓶发酵和产物HPLC分析,该突变株完全丧失了合成他克莫司的能力。在OD14-1摇瓶发酵36h后添加DHCHC类似物反式-4-羟基环己烷羧酸,发酵6d后经HPLC-MS检测发现分子量为773的他克莫司衍生物31-去甲氧基-他克莫司。结论构建了可用于他克莫司突变生物合成的基因工程菌Streptomyces sp.OD14-1,并通过外源物质的添加获得31-去甲氧基-他克莫司。

突变工程菌pCBH4高产PHAs分子机制的初步研究(英文)

聚羟基烷酸酯(PHAs)是一类以胞内颗粒形式存在的能被完全生物降解的贮能物质。本研究利用生物信息学的方法初步分析了离子束诱变选育出的突变工程菌pCBH4高产PHAs分子机制。为了分析高产PHAs特性,实验首先提取pCBH4突变菌株含有合成PHAs基因的质粒并转化受体菌DH5α,然后根据原始序列设计引物,从突变株pCBH4中扩增出phaA、phaB和phaC基因并对其进行了序列分析。结果表明:转化菌表现出高产PHAs特性;phaA基因在序列末端有7处碱基发生改变,这一变化导致5个氨基酸发生了改变;phaC基因也发生了类似的变化。从这些结果可以推断pCBH4突变株高产PHAs不是由于工程菌基因组遗传变异所致,可能是phaA和phaC基因突变的结果。

RBM8a基因的基本生理功能和病理生理研究进展

真核生物mRNA的生物合成包括细胞核前体mRNA转录后修饰、mRNA的出核转运以及监控过程。剪接后的mRNA可与外显子连接复合体结合,外显子连接复合体(EJC)参与协调某些mRNA生物合成的下游步骤。作为EJC核心蛋白之一的RBM8a,与其他核心因子一起参与无义介导的mRNA降解以及增强翻译过程。此外,RBM8a还参与其他的细胞进程,RBM8a基因突变或异常表达可导致生理异常及病变。

杂合抗生素的研究进展

根据抗生素生物合成原理而设计的突变生物合成和杂交生物合成,以及利用抗生素产生菌的遗传学原理而设计的原生质体融合、基因工程,用于产生杂合抗生素的研究已在众多的实验室获得成功。本文对这四个方面的新进展作了综述。

雷帕霉素及其衍生物开发现状、作用机制及生物合成研究进展

目的介绍了近年来雷帕霉素及其衍生物的开发现状、作用机制与生物合成途径,探讨了通过前体定向生物合成与诱变生物合成的方式,获得雷帕霉素衍生物的研究进展,展望了雷帕霉素及衍生物的研究前景。方法分析、归纳、总结近年来发表的相关文献。结果与结论雷帕霉素及其衍生物是新型强效的免疫抑制剂与抗肿瘤药物,具有抗真菌、抗增殖及潜在延长哺乳动物寿命周期等作用。采用前体定向生物合成、诱变生物合成与组合生物合成的方式,可快速获得其具药理活性的衍生物。基于生物合成途径,采用系统生物学相关手段可获高产工程化菌种应用于工业化生产。

产苦马豆素疯草内生真菌Alternaria SectionUndifilum oxytropis的诱变筛选

【背景】疯草是黄芪属和棘豆属有毒植物的统称,疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis是从疯草中分离获得的一种具有产生苦马豆素(swainsonine,SW)能力的真菌。因其产物SW一方面体现出良好的抑制肿瘤细胞生长、浸润和转移作用及潜在的抗艾滋病病毒等多种药用活性,另一方面牛羊因大量误食疯草能导致中毒,对草原畜牧业健康发展造成了严重的危害,受到研究人员的广泛关注。但由于疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制尚不清楚,严重制约了后续通过生物发酵大量获得SW用以抗肿瘤机制研究与临床应用,以及通过基因工程手段对疯草进行脱毒育种,使疯草成为牛羊可食用、无毒的天然牧草。【目的】利用有效的研究手段,阐明Alternaria Section Undifilum oxytropis产苦马豆素生物合成机制。【方法】以Alternaria Section Undifilum oxytropis为出发菌株,分别采用紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变的3种诱变方式,在不同诱变时间、诱变剂量等条件下对其进行了诱变筛选研究。通过测定不同诱变方式和作用条件下对菌株的致死率,经发酵培养、连续5代传代培养、并采用α-甘露糖苷酶活性分析法检测诱变菌株产苦马豆素含量变化,优化确定了不同诱变方式下最佳诱变条件,并将优势突变菌株接种马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar,PDA)和改良察式液体培养基,连续培养32 d,测定并绘制了突变菌株D4和UD1的生长周期曲线。【结果】经上述3种诱变方式处理后,分别获得1株产苦马豆素含量变化较大、能稳定连续传代培养的突变菌株U4、D4、UD1。其优化的诱变条件,紫外辐照为辐照处理160 s,亚硝基胍化学诱变为亚硝基胍诱变剂量6μL、诱变处理时间5 min,紫外辐照与亚硝基胍复合诱变为紫外辐照20 s,亚硝基胍诱变剂量2μL,诱变处理时间5 min。突变菌株U4、D4、UD1较原始菌株,菌落形态偏小、中间凸起,菌落颜色呈微粉色或白色,且其产苦马豆素含量均有显著变化,其中U4突变菌株产苦马豆素量平均增加16.02%(P<0.01)、D4突变菌株产苦马豆素量平均降低23.58%(P<0.01),UD1突变菌株SW产量平均增加21.87%(P<0.01),但D4、UD1突变菌株生长周期与出发菌株一致,均为24 d。【结论】通过紫外辐照诱变、亚硝基胍化学诱变、紫外辐照与亚硝基胍复合诱变方法,成功筛选出产苦马豆素含量变化较原始菌株差异较大的3株突变菌株U4、D4、UD1,这为后续利用高通量测序等分子生物学手段,在分子水平上阐释疯草内生真菌Alternaria Section Undifilum oxytropis关键基因、关键酶在其生物合成苦马豆素机制关系方面奠定研究基础。

‘红早酥’梨花青苷合成相关基因的克隆及表达分析

以‘早酥’梨(Pyrus bretschneideri Rehd.)及其红色芽变‘红早酥’梨为试材,采用同源克隆方法,分别从这2种材料的果皮中,得到花青苷生物合成途径中3个关键结构基因PbCHS、PbDFR、PbUFGT和2个调控基因PbbHLH、PbMYB10的cDNA编码区序列。生物进化树分析表明,这5个花青苷合成相关基因序列与其他植物均具有较高的同源性。通过荧光定量PCR,研究花青苷合成基因在不同幼嫩组织器官中的表达情况。结果表明,大部分基因在‘红早酥’梨的幼叶、叶柄、花瓣、幼果、花梗中的表达量均高于‘早酥’梨,其中PbUFGT和PbMYB10在二者中的表达差异尤为显著。

CRM9与兔抗人IgG连接方法探讨

目的:用直接偶联法构建新型蛋白兔抗人IgGCRM9.方法:分别应用异型双功能连接剂(m Maleimido benzoyl N hydoxysuccinimideester,MBS)和N琥珀酰亚胺3(2吡啶二巯基)丙酸盐(SPDP)将兔抗人IgG多抗和白喉毒素突变体(CRM9)进行连接,制备出新的蛋白.结合后的蛋白经SephacrylS300分离纯化,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖电泳证明二者的结合情况.采用酶联免疫法检测IgG与CRM9按不同比例反应后所构建的蛋白复合体中抗体部分的活性.结果:用MBS连接剂连接IgG与CRM9后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出的条带明显滞后于IgG所显示的条带,而在琼脂糖凝胶电泳中IgG与CRM9混合反应的样品所显示的两条条带均与IgG和CRM9单独所在的条带一致.酶联免疫实验测得的各组A450nm值表明,IgG与CRM9按1∶1和1∶3两种比例制备的样品对抗体活性影响最小,而按1∶5和1∶两种比例制备的蛋白,抗体活性受到很大的抑制.结论:兔抗人IgG与CRM9可以通过MBS结合,二者在1∶1～1∶3之间的比例时,可以有较好的连接,而且对抗体活性的影响最小.SP DP则不适用于本实验中的两种蛋白的连接.这将为免疫毒素的新型连接提供有效的方法.

突变生物合成在微生物药物领域的研究进展

突变生物合成作为产生抗生素衍生物的重要手段,自20世纪70年代兴起以来,发挥了巨大作用,已开发出许多至今在临床上仍广泛使用的抗生素品种。随着基因技术的发展,突变生物合成技术可直接对次级代谢途径中一特定酶基因进行改造获得突变株,大大提高了工作效率和准确性。本文综述了突变生物合成技术在微生物药物领域的应用,特别是结合基因技术进行突变生物合成研究的新进展。

VWF前导肽对D1区VWF突变体的作用机制研究

目的:探讨野生型VWFpp与前导肽D1区VWF突变体共转染是否能纠正D1区突变引起的VWF缺陷。方法:将4个定点诱变的VWF D1区突变体质粒单独瞬时转染HEK 293细胞;VWF D1区突变体质粒与VWFpp质粒共同瞬时转染HEK 293细胞,通过ELISA、垂直多聚体电泳分析细胞上清液及裂解液中的VWF,免疫荧光共聚焦显微镜下观察细胞内质网中VWF的滞留。结果:在垂直多聚体分析中,VWF突变体和VWFpp共表达后VWF多聚体条带消失。共表达后,无论是细胞上清液还是裂解液中VWF抗原含量均减少。在免疫荧光共聚焦显微镜下,共表达后,虽然细胞内VWF含量减少,但VWF在内质网滞留比率下降。结论:VWFpp虽然能减少D1区VWF突变体在内质网的滞留,促进了VWF在亚细胞器间的转运,但进一步抑制了D1区突变体VWF的合成及分泌。

StyS激酶自磷酸化对Pseudomonas putida B3中靛蓝生物合成的调节作用

在恶臭假单胞菌Pseudomonas putida B3中,靛蓝生物合成关键酶基因styAB上游存在一个二元调控系统StyS-StyR。StyS蛋白属于激酶家族,是磷酸化信号转导的重要媒介,但激酶StyS的自磷酸化传导机制对靛蓝生物合成的调节作用尚未探明,因此,研究以Pseudomonas putida B3中激酶蛋白StyS作为研究对象,发现了两个磷酸化结合位点,构建了磷酸化位点突变株。通过分析野生菌株P.putida B3、styS基因缺失菌株P.putida B3-ΔstyS、styS基因回补菌株P.putida B3-ΔstyS-8和磷酸化位点突变株P.putida B3-ΔstyS-1之间的靛蓝产量及酶活发现,P.putida B3产量为10.14 mg/L,P.putida B3-ΔstyS-8产量为3.63 mg/L,磷酸化位点突变菌株无激酶活性且失去了产生靛蓝的能力。结果表明,StyS自磷酸化作用在靛蓝发酵体系中起重要作用。研究结果将为靛蓝生物合成途径的进一步研究提供参考。

开发微生物来源天然产物的新技术

微生物在药物的开发中具有十分重要的作用,主要表现在微生物的次级代谢产物具有结构多样性、活性广泛性和临床有效性,其中许多化合物或其衍生物已经成为临床治疗多种疾病的药物。开发微生物来源的天然产物包括寻找新资源和革新新技术。本文介绍微生物药物的优点和局限性,获得更多微生物资源的途径以及微生物药物研发中5种新技术的应用,并探讨了各自的局限性。

人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc及其突变型重组腺病毒的获得和在乳腺癌细胞中的表达

获得人成纤维细胞生长因子受体2Ⅲc(FGFR2Ⅲc)及其S252W突变型重组腺病毒,感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,为下一步研究FGFR2Ⅲc基因的功能和作用机制奠定基础。以本实验室保存的含FGFR2Ⅲc基因的质粒为模板,PCR扩增得到FGFR2Ⅲc基因,重叠延伸法PCR获得FGFR2ⅢcS252W突变型基因;分别将上述野生型和突变型基因克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,得到重组穿梭质粒pAdTrack-FGFR2Ⅲc和pAdTrack-FGFR2ⅢcS252W,DNA测序证实。Pme I酶切后分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ-5183感受态细菌同源重组,得到的重组表达质粒Ad-FGFR2Ⅲc和Ad-FGFR2ⅢcS252W Pac I酶切线性化后转染HEK293A细胞进行重组腺病毒的包装和扩增,通过GFP报告基因观察病毒表达情况。收集重组病毒颗粒并测定滴度,进一步感染乳腺癌细胞MDA-MB-231,RT-PCR和Western blotting方法检测目的基因的表达,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法和流式细胞术分析细胞增殖情况。结果表明,成功构建了人FGFR2Ⅲc及其S252W突变型基因的重组腺病毒表达载体,获得的重组腺病毒颗粒能高效感染MDA-MB-231细胞,并表达目的基因。MTT结果显示FGFR2Ⅲc和S252W均能抑制MDA-MB-231细胞增殖,S252W抑制效果更加明显。流式细胞术表明FGFR2Ⅲc和S252W均能使MDA-MB-231细胞周期停滞于G0/G1期,抑制细胞增殖。

3-羟基丙酸生产菌育种的研究进展

3-羟基丙酸是一种无手性有机酸,同时也是工业上重要的平台化合物,广泛应用于许多化工产品的合成,如聚3-羟基丙酸、丙烯酸和丙烯酰胺。该文综述了国内外近年来对3-羟基丙酸菌株选育工作的研究成果,尤其是基因工程育种方面的研究工作,并对3-羟基丙酸菌种选育存在的问题及下一步研究方向进行探讨。