玉米Mutator转座子的研究进展

玉米Mutator(Mu)转座子具有转座活性高、诱变能力强的特点,利用Mu插入突变可以构建大型玉米突变体库,从而有利于分离和克隆玉米的重要功能基因。介绍了Mu转座子的种类和特性,以及Mu因子在玉米突变群体构建和基因克隆中的应用,旨在为利用Mu转座子开展玉米功能基因组学研究和玉米分子标记辅助育种提供借鉴。

玉米Mutator转座子

Mutator转座子因其拷贝数高、正向突变频率高、倾向于插入低拷贝的DNA序列等独特的遗传特性,已成为基因组学研究中重要的诱变剂之一。本文对Mutator转座子的发现、Mutator家族的分类、Mutator转座子的特性、Mutator元件的表观调控、Mutator转座子标签在植物基因组学研究中的应用作了综述。对Mutator系统的研究进行了展望。

玉米Mutator转座子系统的应用及展望

转座子标签法是近年来发展起来的一种非常有效的分子生物技术,是一种利用TEs插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离TEs插入的旁邻序列,克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物的功能基因组学研究中十分有用。玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统三大类。其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10^(-5)~10^(-4),比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由Mutator转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法,对相关的突变基因进行克隆。当前通过这种方法,已经克隆出一些重要的基因。本文主要介绍了Mutator转座子的应用,并对Mutator转座子系统的研究前景进行了展望。

Mutator转座子介导的玉米甜质突变体侧翼序列克隆

为了探讨Mu转座子使玉米发生甜质突变的分子机理,利用Mu-AFLP方法分离Mutator转座子插入位点的侧翼序列,并根据侧翼序列的延伸设计一对特异性引物P1、P2,验证转座子插入的真实性,同时对插入位点所在的基因进行生物信息学分析。结果显示:侧翼序列长299 bp,插入位点位于第3染色体,该转座子的插入属于真实插入;突变基因全长5 746 bp,共编码592个氨基酸;所编码蛋白的理论分子量为67.5 k Da,疏水性氨基酸含量为42.06%,具有10个跨膜结构域,属于亲水性内膜蛋白。该结果为更好地利用Mutator转座子创制甜玉米新种质奠定了基础,也对揭示玉米胚乳发育与淀粉合成机制具有重要意义。

Mutator转座子及MULE在植物基因与基因组进化中的作用(英文)

Mutator(Mu)转座子是植物中已发现的转座最活跃的转座子,其高的转座频率及趋向于单拷贝功能基因转座的特性,使该转座子成为玉米功能基因克隆的主要方法。Mu转座子的同源类似因子广泛存在于被子植物基因组中,而且同一基因组中往往具有多种变异类型。它不仅具有其他DNA转座子在基因和基因组进化中的普遍作用,而且具有能够承载基因组内功能基因和基因片段的载体功能,这种载体Mu转座子(Pack-MuLEs)能够在基因组内移动众多的基因片段,从而对基因和基因组进化产生作用。Mu转座子的同源序列发生在水稻与狗尾草之间的水平转移提供了高等植物核基因水平转移的首个例证。对Mu转座子的了解促进了我们对动态基因组概念的认识。文章对Mutator转座子的发现、转座特征、基因标签应用等的研究进展进行了综述,对Mu转座子家族的同源序列进行了分类,讨论了该转座子在基因组进化中的作用,分析了应加强研究的问题。

玉米Mutator转座子突变体库研究进展

Mutator转座子以其高的正向突变率、倾向插入基因富含区和低拷贝序列区等独特的遗传特性,使其在玉米基因功能的研究以及突变体库的构建中发挥了重要的作用。本文从群体大小、群体优缺点以及利用途径等方面对Mutator介导的玉米突变体库作了详细的介绍,以期能为我国玉米基础研究工作者提供启示和借鉴。

Mutator转座子介导的玉米胚大小突变体的遗传分析

玉米胚大小是由多基因控制的数量性状。本研究以Mutator(Mu)转座子诱变的M5和BC2F2群体为材料,采用数码成像和Photoshop软件相结合的方法测定胚大小,计算胚面积与籽粒面积;以胚面积和籽粒面积的比值(SST)作为胚性状评价标准,对M5和BC2F2诱变材料进行遗传分析。结果表明:在2种世代的诱变群体中共获得了8个胚大小突变体;用MuTail-PCR方法分析突变体材料Mu插入位点的侧翼序列,获得了Mu因子真实性插入的2个靶位点;经Blastn功能分析,该2个靶位点可能与编码鸟嘌呤核苷酸结合蛋白和一种泛素连接酶有关。这些突变体为进一步克隆控制胚大小的基因提供了宝贵的材料。

Mutator转座子介导的PPR插入位点分离与遗传分析

利用Mutator(Mu)诱变群体,进行Mu因子插入PPR(Pentatricopeptide Repeats,PPR)位点的分离,及其插入真实性验证。以含活性Mu转座子为父本和玉米自交系综31(Z31)杂交,经与Z31多代回交和自交获得BC3F2为材料,利用Mu-AFLP方法分离Mu插入侧翼序列的PPR位点,且验证插入真实性。采用Mu-AFLP方法获得Mu因子插入侧翼序列14条,去除冗余序列2条和重复序列8条,其余4条为Mu因子插入的基因序列,经基因型遗传分析验证了2条侧翼序列为真实插入。经功能分析,其中1个为PPR突变位点,且Mu因子插入于该基因5’UTR区第121bp和第122bp碱基之间。经基因组定位和功能分析,显示Mu插入位点定位在第6染色体上,为PPR基因家族,能够编码PPR蛋白,推测可能与玉米叶色变化有关。

Mutator转座子介导的玉米插入突变体库的构建及遗传评价

以Q105,WW51,115F,V26-2,919J为Mutator转座子供体材料,与本地优良玉米自交系受体材料Hz85,W328以及S-Mo17Rf3Rf3杂交,获得26718单株的插入诱变F1群体(M1).田间鉴定M1单株的生物学特征及农艺学性状的表型突变,室内考察突变单株自交果穗M2籽粒性状的突变类型,并以斑点籽粒出现的频率评价Mu因子的转座频率.结果表明,在所构建的Mu介导的玉米插入突变体库中,以W328为母本(BzBz)的M1群体平均田间表型突变频率为0.07;以W328×Mu的M2果穗斑点籽粒的出现频率评价的Mu转座频率为0.121802;在22500个S-Mo17Rf3Rf3×Mu单株中,发现了5个S型玉米细胞质雄性不育突变单株,突变频率为2.2×10?4.利用优化的MuTAIL-PCR技术分析了99条转座子插入位点的侧翼序列,归并整理后获得59条(每条约400核苷酸序列)非重复靶位点序列.对59条序列非重复的Mu因子插入产生的9bp靶位点正向重复序列进行同源性比较分析,结果表明,Mu的插入有序列热点.经生物信息学分析后注释了27条与玉米、水稻等植物核苷酸数据库中匹配值较高的功能序列.利用比较基因组学方法将36条单一基因序列定位在玉米遗传图谱上,有多条Mu插入靶位点序列定位在单个标记位点上.分析发现,8条Mu插入靶位点序列的预测功能与其相应的定位标记的功能具有一致性.Mu插入突变体库的构建与遗传评价为利用Mu转座子进一步发掘玉米基因、深入开展玉米功能基因组学研究搭建起重要的技术与材料平台.

玉米Mutator转座子的结构特征与作用性质

玉米转座子系统主要有En/Spm系统、Ac/Ds系统和Mutator系统3大类,其中Mutator转座子易于插入到基因内部及基因周围,引起的正向突变频率为10-4~10-5,比野生玉米高出近30倍,所引起的突变大部分为隐性突变。由转座子引起的突变,可以通过TAIL-PCR的方法对相关的突变基因进行克隆。本文主要对Mutator转座子的种类、结构特征和作用性质进行综述,并对Mutator转座子的研究应用进行展望。

干旱条件下玉米转座子插入关联的表观调控分析

【目的】干旱是全球范围影响玉米生产的最主要胁迫因素之一。解析抗旱性的遗传基础与分子机制为玉米的抗旱改良提供依据。【方法】利用代表性玉米自交系,以叶片相对含水量和散粉-吐丝间隔为指标开展田间抗旱性精准鉴定。筛选2个抗旱性极端差异的自交系,开展基因组重测序分析和转座子插入鉴定;利用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)方法分析不同水分处理下叶片和根系组织的DNA甲基化水平;同时利用转录组测序方法对相同样品的基因表达进行分析;通过比较分析获得2个材料间的转座子插入缺失变异、差异甲基化区域和差异表达基因,并综合分析这三者间的相关关系。针对前期克隆的玉米抗旱基因ZCN7,分析该基因区域转座子插入缺失变异介导的DNA甲基化和基因表达变化情况。【结果】在田间干旱处理下,自交系H082183的叶片相对含水量和散粉-吐丝间隔均与正常处理没有显著差异,而旅28在所有试验材料中表现最低的叶片相对含水量和最大的散粉-吐丝间隔。利用H082183和旅28这两个抗旱性极端差异的玉米自交系开展基因组重测序和转座子插入分析,分别检测到333754和333296个转座子插入,其中,有89954个转座子插入在2个自交系间具有多态性。基因组DNA甲基化分析表明,转座子、内含子和启动子区域较外显子和非编码区呈现较高的CG和CHG甲基化水平,经差异甲基化分析,在2个自交系间共检测到41352个差异甲基化区域,其中60%的差异甲基化区域位于转座子插入缺失变异的上下游5 kb范围内。基因表达水平与基因的CG和CHG甲基化水平负相关,在2个自交系干旱下的叶片和根系中分别鉴定到4196和3500个差异表达基因,其中19.5%和19.7%与差异甲基化区域关联。通过对抗旱相关基因ZCN7的研究,发现该基因34 kb区间内的3个LTR类转座子插入,造成自交系旅28在干旱和正常处理下的CG和CHG甲基化显著高于抗旱自交系H082183,并且H082183中ZCN7表达量也显著高于旅28。【结论】揭示了转座子介导的表观遗传调控在玉米响应干旱胁迫中的重要作用,进一步扩展了转座子变异和DNA甲基化调控抗旱基因ZCN7表达的分子机制。

玉米非自主性转座子rDt的体细胞转座序列特征

Dotted/rDt是玉米遗传学中最早发现的双元转座子系统之一。为了揭示玉米中非自主性转座子rDt在其自主性转座子Dt调控下的转座遗传特性,选取了a1-rDt;Dt和a1-m1::rDt;Dt2个rDt转座子插入突变等位基因,检测玉米籽粒紫色斑点表型差异的遗传基础,利用巢式PCR与特异性酶切相结合的方法检测并鉴定了这2种材料叶片组织中rDt体细胞转座的印迹序列类型。通过构建遗传杂交群体,统计分析各群体的后代籽粒表型以及A1野生型基因的回复突变频率。结果显示,在籽粒糊粉层紫色斑点大小均一但数目极低的a1-rDt;Dt材料中,仅检测到2种体细胞转座的印迹序列类型,其中1种是没有转座子插入前A1野生型。而在籽粒糊粉层紫色斑点大小不一、排列密集的a1-m1::rDt;Dt材料中可以检测到5种体细胞转座的印迹序列类型,其中3种类型均保持A1'回复突变基因的开放阅读框;同时,a1-m1::rDt;Dt材料中A1'的回复突变频率是a1-rDt;Dt材料的大约2.6倍。研究表明,rDt在a1插入位点体细胞转座后的修复产物序列组成相对简单,与Ac/Ds等hAT超家族转座子相似,且rDt体细胞转座产生的印迹序列类型及丰富度是两个a1基因插入突变体中A1'回复突变频率高低及玉米籽粒糊粉层表型差异的遗传基础。

DNA转座子异源活性的大规模调查揭示其功能多样性并扩展基因工程工具箱

自1948年美国科学家Barbara McClintock首次报道转座子以来[1],这类跳跃遗传元件对宿主演化的重要意义逐渐被揭示[2~5]。其中,DNA转座子作为主要类型之一,长期以来备受关注。然而,由于以往多为个案研究,DNA转座子活性的决定因素与进化模式的一般规律尚不清晰。尽管DNA转座子可作为基因工程工具用于插入诱变或转基因载体[6,7],但目前只有Sleeping Beauty(SB)等少数几种转座子得到了开发和广泛应用。因此,系统挖掘具有不同功能特点的转座子工具的工作亟待开展[8]。

IS200/IS605转座子家族编码的核酸酶OgeuIscB基因编辑体系的优化

目的提升来源于IS200/IS605转座子家族的RNA引导的核酸内切酶OgeuIscB的基因编辑效率。方法利用OgeuIscB蛋白已解析的晶体结构,计算氨基酸与核酸之间的原子距离,将距离小于10的非正电荷氨基酸残基突变为精氨酸(arginine,R)以提高OgeuIscB与核酸的亲和力,通过人胚肾293T细胞内源性位点验证不同突变体的基因编辑效率。结果经过两轮迭代突变,发现Q376R-S456R和A401R-S456R这2个双突变体在不同细胞系的多个内源性位点上均能显著提升OgeuIscB的基因编辑效率。结论基于结构对OgeuIscB蛋白进行理性蛋白质工程化改造,能够提升OgeuIscB核酸内切酶活性,为将其作为一种有效的基因编辑工具提供了实验依据。

Trigger转座子衍生蛋白1对肝癌细胞生长的影响

细胞周期失调是肿瘤重要的标志之一,生物信息学分析结果表明,Trigger转座子衍生蛋白1(TIGD1)在临床肝癌组织中高表达且与细胞周期相关,但相关机制未知。为了探究TIGD1调控肝癌细胞生长的具体机制,首先,利用shRNA质粒构建靶向敲低TIGD1的肝癌细胞系Hep3B,并分析TIGD1敲低对肝癌细胞生长的影响,结果表明细胞生长受阻;接着,通过细胞流式技术分析TIGD1敲低对肝癌细胞周期进程的影响,结果显示,TIGD1敲低的Hep3B细胞系的细胞周期进程主要阻滞于G2/M期;然后,通过免疫沉淀(IP)实验验证TIGD1可能发生相互结合的蛋白分子,结果表明,TIGD1可能与Aurora激酶相互作用蛋白1(AURKAIP1)存在相互结合,进一步的Co-IP实验证实了TIGD1和AURKAIP1之间的相互作用。已知AURKAIP1可调控Aurora激酶A(AURKA)的蛋白酶体降解途径,AURKA是一种有丝分裂调控蛋白,与细胞周期进程密切相关。文中进一步探究TIGD1对AURKA蛋白水平的影响,实验结果表明,在TIGD1敲低的情况下,AURKA在Hep3B细胞系中的蛋白水平明显下调,mRNA水平没有明显变化。综上所述,TIGD1可能通过调控AURKA在肝癌细胞中的转录后水平来影响细胞周期进程,从而影响肝癌的发生发展。

V(D)J重排酶RAG与转座子及转座子基因编辑工具的关系

V(D)J重排是高等脊椎动物产生特异性抗体和受体的基础事件,是适应性免疫的特征,其关键酶重组激活基因(RAG)及V(D)J重排如何起源是免疫学中的一个基础问题。多种证据表明RAG和V(D)J重排可能起源于转座事件。本文就V(D)J重排酶RAG的功能,及其和原始RAG转座子的关系进行论述,同时思考RAG转座子和转座子基因编辑工具的联系,旨在为新型基因编辑工具研发和利用提供参考。

玉米Mutator转座子结构特征和基因克隆的研究进展

Mutator(Mu)转座子是已发现的植物中转座活性最强的转座子,其较高的转座频率以及趋向于插入单拷贝功能基因转座的特性,使其成为构建玉米突变体库的一个主要方法。当前玉米B73品系基因组测序已经基本完成,利用反向遗传学方法,研究玉米基因的功能更为方便。文中简要介绍Mu转座子的结构特征以及Mu的分类,介绍3种克隆Mu转座子标签插入位点侧翼序列的技术,对Mu研究所存在的问题进行分析,展望Mu的应用。

Mutator超家族转座子研究进展

转座子是一类可以在基因组中不同遗传位点间移动的DNA序列,在其转移过程中有时会伴随自身拷贝数的增加。作为基因组的重要组成部分,转座子可以通过多种方式影响宿主基因及基因组的结构与功能,进而在宿主的演化过程中扮演重要角色。目前依据转座过程中间体类型的不同可以将其分为I类转座子和II类转座子。Mutator超家族转座子是20世纪70年代在玉米(Zea may L.)中发现的一类特殊的转座子,其属于II类转座子,广泛存在于真核生物基因组中,包含遗传特征明晰可分的众多转座子家族。此外,该超家族转座子转座频率高,倾向于插入基因富含区及低拷贝序列区,可快速产生大量新的突变体,目前已被广泛应用于正向及反向遗传学研究。本文结合近年来相关研究结果,围绕Mutator超家族转座子的分类组成、结构特征、转座机制、插入偏好、靶位点重复序列以及玉米自主性MULEs元件展开综述,并对转座子研究面临的问题及未来研究方向进行了探讨,旨在与研究领域内的同行探讨相关研究的可能突破点、未来发展方向及可能产生的重大影响。

金葡菌转座子测序文库的构建及促蛋白酶的活性基因鉴定

背景金黄色葡萄球菌能产生多种蛋白酶引起侵袭性感染,转座子测序技术是发掘基因功能的有力工具,从基因组层面分析促进金葡菌蛋白酶活性基因对其预防及治疗具有重要作用。目的构建能用于转座子测序的突变文库,筛选及鉴定促进蛋白水解活性基因。方法采用基因合成及无缝克隆技术构建带有mariner转座酶的质粒pSATn,并使用脱水四环素红霉素诱导转座并富集形成突变文库。通过牛奶平板对金葡菌蛋白酶水解活性相关基因进行筛选并使用半随机PCR对转座子插入位点进行鉴定。结果成功构建转座子末端均带有MmeⅠ酶切位点金葡菌转座子突变文库,共筛选出26株蛋白酶缺陷克隆菌株,涉及22个基因。其中,新基因pde2转座子插入株显示蛋白水解活性减弱,生物被膜形成能力显著增强,大蜡螟幼虫致死能力显著降低的特征。结论本研究构建的转座子突变文库为后续转座子测序技术的开展奠定基础,为了解金葡菌蛋白水解活性调控的分子基础提供了新的见解,新筛选的基因pde2有望成为控制金黄色葡萄球菌感染的新靶标。

小麦幼苗活性LTR反转录转座子筛选及其对非生物胁迫的响应

LTR(长末端重复,long terminal repeat)反转录转座子占小麦基因组的60%以上,筛选小麦基因组中具有转座活性的LTR反转录转座子,并分析其在非生物胁迫下的响应,对研究反转录转座子在小麦抗逆境胁迫中的作用具有重要意义。本研究通过生物信息学分析,从转座子数据库(TREP database)中筛选出4个具有完整结构的LTR反转录转座子Fatima、Wis、Angela和Babara;同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、甲基化特异PCR(methylmion specific PCR,MSP)和转座子展示(transposon display,TD)技术分别分析了它们在盐、ABA、H2O2和干旱等处理的小麦幼苗期(二叶一心)叶和根中的表达水平、甲基化水平和转座活性变化。结果表明,这4个反转录转座子在正常条件下均存在基础水平的转录,并且能够响应上述4种胁迫而发生转录水平的变化,且在相同胁迫条件下表达水平变化趋势一致。Fatima、Angela和Babara在非生物胁迫处理下表达水平的提高与其甲基化水平的降低有关,Wis则相反。反转录转座子LTR序列含有胁迫响应顺式作用元件,但在非生物胁迫条件下顺式作用元件对这4个反转录转座子的调控作用不显著。与叶相比,这4个反转录转座子在根中对胁迫的响应程度更高,且在盐和ABA处理下转座活性更强。本研究将有助于进一步揭示LTR反转录转座子对非生物胁迫的响应规律,为进一步研究利用反转录转座子进行小麦抗逆育种的遗传改良积累资料。