蒙古冰草MwLEA3基因植物表达载体的构建

以植物双元表达载体pCAMBIA2300为基础,设计分别带有酶切位点XbaI和PstI的一对引物,从克隆载体pGM-T-MwLEA3中扩增到目的基因MwLEA3。用XbaI和PstI双酶切该目的基因及表达载体pCAMBIA2300,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pCAM-MwLEA3。通过冻融法将所获得的植物表达载体重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将MwLEA3基因导入植物提高相关抗性奠定了基础。

蒙古冰草MwLEA3基因ihpRNA表达载体的构建

采用RT-PCR方法从蒙古冰草中克隆出MwLEA3基因的特异性cDNA序列,并连入克隆载体pGM-T中。根据植物中ihpRNA原理,成功构建了35S启动子调控的具有MwLEA3基因反向重复结构的ihpRNA表达载体pART27-MwLEA3(HB)-MwLEA3(EX),并通过冻融法转化将MwLEA3基因的ihpRNA表达框架成功导入根癌农杆菌LBA4404中。