Mx基因稀有密码子和mRNA结构及大肠杆菌表达优化

通过对稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构的分析,构建了4种重组表达菌株BL21(DE3)/pET-Mx,Rosseta(DE3)/pET-Mx,BL21(DE3)/pGEX-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx,在大肠杆菌中进行Mx基因的表达,Rosseta(DE3)/pET-Mx和Rosseta(DE3)/pGEX-Mx重组表达菌中都获得了表达,Western blotting检测到了特异的75 kDa表达产物。实验结果证明稀有密码子和mRNA翻译起始区二级结构对Mx蛋白表达都有影响,选择适用于稀有密码子表达的菌株Rosetta(DE3)有利于Mx蛋白的表达,同时翻译起始区二级结构能值较低的表达载体pGEX-Mx获得的表达量明显增高。实验中首次获得了重组表达鸡全长Mx蛋白的大肠杆菌重组菌。

鸡Mx蛋白基因诱变修饰及抗病活性

【目的】进一步研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸的变异与鸡群抗病性的相关性。【方法】本实验利用PCR突变技术将鸡Mx蛋白基因的全长cDNA第2032位的碱基由G突变为A(既631位氨基酸的改变),并将突变的Mx基因插入真核表达载体pcDNA3.0,重组表达载体转染COS-Ⅰ细胞后,进行RT-PCR与间接免疫荧光(IFA)鉴定。【结果】对鸡Mx蛋白基因的cDNA进行PCR诱变修饰正确,构建了能够正确表达鸡Mx蛋白的重组真核表达载体;诱变修饰重组Mx蛋白对抗新城疫病毒(NDV)感染分析结果显示,重组Mx蛋白具有较强的抗新城疫病毒生物活性。【结论】为下一步研究鸡Mx蛋白的抗病机理与制备抗病转基因鸡奠定了坚实的基础。

鸡抗病毒Mx蛋白修饰及其真核表达载体的构建

利用高保真RT-PCR的方法从Poly(I).Poly(C)诱导的鸡成纤维细胞总RNA中扩增出鸡全长MxcD-NA,扩增产物克隆到pMD19-T Simple载体上,利用PCR突变技术将其第2 032位的碱基由G突变为A,经克隆测序证实突变成功后,将已突变的Mx基因插入真核表达载体,通过PCR、酶切鉴定插入片段正确,提取质粒转染COS-Ⅰ细胞进行RT-PCR鉴定。结果表明:正确克隆了鸡Mx基因,并成功对该基因进行PCR诱变修饰,构建了能够表达鸡Mx基因的重组真核表达载体,为Mx基因体内外表达及生物学活性的进一步研究奠定了基础。

睾丸注射Mx基因生产抗病转基因鸡初探

采用脂质体转染法,将线性化pcDNA3.0-MMx质粒随机打点注射入18周龄青年公鸡睾丸内,术后观察公鸡日常活动、常规检测精子;采集转染后25、50、75 d公鸡精液,并于转染70 d后人工采精,授精于正常母鸡,产生F1后代,采用常规PCR检测技术,检测证实外源Mx基因的整合情况,探讨外源Mx基因在鸡体内稳定整合和遗传的能力。结果表明:手术法转染外源基因过程对公鸡的生殖功能未造成明显影响;PCR检测证实外源Mx基因已整合到精子基因组,且能通过体外受精传递给后代,后代PCR检测的阳性率为27.27%(6/22)。证明外源Mx基因能稳定整合到基因组上,睾丸内注射法可能是一种切实可行、易于推广的制备抗病转基因鸡的方法。

Mx蛋白研究进展

Mx蛋白是干扰素诱导表达的抗病毒蛋白家族中的成员之一。人、哺乳动物、鱼类、家禽体内都有Mx蛋白。Mx蛋白具有GTP酶活性 ,在其肽链氨基端均包含一个氨基酸序列高度保守的的三联GTP结合区域 ,羧基端存在有亮氨酸拉链区域。人和鼠的Mx蛋白有抗病毒活性。家禽中鸭的Mx蛋白无抗病毒活性 ;鸡的Mx蛋白的抗病毒活性受 6 31位氨基酸的影响 ,当 6 31位氨基酸为天冬酰胺时有抗病毒活性 ,为丝氨酸时则无抗病毒活性。

鸡Mx基因的克隆与原核表达

本研究旨在通过克隆鸡Mx全基因序列进而进行该基因的原核表达,获得具有生物学活性的蛋白。利用poly I:C诱导鸡胚成纤维细胞Mx基因表达,克隆了Mx基因全长cDNA序列,将开放阅读框(ORF)连接构建于表达质粒pGEX-4t-2中获得重组表达载体pGEX-Mx,转化Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导后检测。表达产物检测显示该蛋白的相对分子量为75 ku。说明获得了Mx基因的高效表达,为进一步进行Mx基因的活性检测以及利用Mx蛋白进行抗病毒转基因的研究奠定了基础。

天然免疫抗病毒效应分子Mx蛋白的结构与功能研究进展

Mx蛋白是很多物种中干扰素诱导的抗病毒状态的关键成分.它们是一类动素样GTPase,具有类似动素的结构和功能特点,例如自我组装以及和细胞内膜结合.Mx蛋白独特的性质使其具有广泛的抗病毒活性,它们作用于病毒进入细胞后不久、病毒基因组复制之前,抑制病毒复制周期的早期阶段.已知一些Mx蛋白识别病毒的核衣壳成分,干扰病毒基因组的复制.动素家族某些成员的晶体结构已经得到解析,解析Mx蛋白的晶体结构对理解其抗病毒机制以及防治新生突发病毒有重要意义.

鸡Mx蛋白抗病毒作用研究进展

Mx蛋白是在脊椎动物机体细胞受病毒感染或诱生剂处理时由Ⅰ型干扰素诱导表达的一种抗病毒蛋白。Mx蛋白具有良好的抗病毒能力,靶向许多RNA病毒,诸如流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒等,对某些DNA病毒,例如乙型肝炎病毒也有一定的作用。近年来,基于鸡的Mx蛋白抗病毒作用及机制的相关研究逐渐增多,取得了一些进展。论文就近年来鸡Mx蛋白的抗病毒机制与分子生物学特点进行综述,针对鸡Mx蛋白在抗病毒与品种鸡抗病育种筛选等应用前景进行分析与探讨。

鸡Mx蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

Mx蛋白为GTP酶动态蛋白家族成员,已被证明具有抗禽流感病毒、Thogoto病毒和水泡性口膜炎病毒等的作用。为制备鸡Mx蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以原核表达并纯化的鸡Mx蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,分离脾细胞与SP2/0细胞融合,采用间接ELISA方法筛选阳性克隆,经3次细胞克隆纯化后获得4株稳定分泌抗鸡Mx蛋白抗体的杂交瘤细胞株。间接ELISA测定4株MAb纯化后腹水的效价介于1∶3.2×104～1∶2.5×105之间。Western blot结果证实4株MAb均具有良好的反应性;间接免疫荧光试验表明其中一株MAb与真核表达的鸡Mx蛋白发生反应。本研究为鸡Mx蛋白功能及表达鸡Mx蛋白的转基因动物等研究奠定了基础。

鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达及其抗病毒活性

[目的]研究鸡Mx蛋白在293T细胞中的表达并检测其抗病毒活性。[方法]将鸡的Mx基因克隆入pEGFP-C1载体,经筛选鉴定后磷酸钙法转染293T细胞,并对转染细胞进行荧光分析以及RT-PCR与Western blot鉴定,同时提取细胞蛋白质,微量细胞病变试验检测其抗新城疫病毒的活性。[结果]试验构建的pEGFP-C1-cMx真核表达载体转染293T细胞后,在胞浆中可检测到绿色荧光,RT-PCR与Western blot结果进一步证实,pEGFP-C1-cMx可在293T细胞中表达,微量细胞病变试验显示,表达的融合蛋白可保护鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒感染。[结论]试验构建的pEGFP-C1-cMx表达载体可在293T细胞中表达具有抗新城疫病毒活性的鸡Mx蛋白。

干扰素诱导的鱼类Mx蛋白

Mx蛋白是干扰素诱导表达的蛋白家族中的成员 ,当机体和细胞受病毒感染或诱生剂处理时产生。Mx蛋白和其它干扰素诱导蛋白一起构成宿主细胞的抗病毒状态 ,以达到抗病毒的目的。研究表明 ,Mx蛋白具有抗病毒活性 ,还可能与其它基本生命活动如发育或分化 ,蛋白质分送和生长有关。在鱼类也发现多种Mx蛋白 ,具有Mx蛋白家族的共有特征 :在肽链末端有一个三联ATP/GTP结合区和发动蛋白家族的结构特征序列 ;在蛋白C端存在使Mx蛋白形成三聚体的Leu拉链结构以及定位信号。但是迄今没有发现鱼类Mx蛋白的抗病毒活性。

鸡突变型和未突变型Mx蛋白体外抗病毒活性研究

【目的】研究鸡Mx蛋白第631位氨基酸变异与抗病性的相关性。【方法】用已经构建成功的中国狼山鸡Mx蛋白基因突变型pcDNA3.0-MMx和未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体分别转染鸡成纤维(CEF)细胞和鼠成纤维(NIH-3T3)细胞;利用RT-PCR检测突变型MMx基因和未突变型Mx基因的表达,微量细胞病变抑制法测定重组蛋白抗新城疫病毒(NDV)和水泡性口炎病毒(VSV)的效果。【结果】诱变鸡Mx基因的表达重组蛋白可保护CEF细胞在孵育48 h内免受NDV的感染;转染突变型pcDNA3.0-MMx真核表达载体的NIH-3T3细胞在孵育60 h内亦未受到VSV的浸染;而转染未突变型pcDNA3.0-Mx真核表达载体的CEF和NIH-3T3细胞在24 h内均发生了病变。【结论】体外重组突变的Mx蛋白在单细胞水平上具有延缓NDV和VSV感染的能力。

鸡Mx基因的原核表达及表达蛋白抗病毒活性初步研究

将鸡Mx基因克隆入pET-32a载体,筛选鉴定后将重组阳性质粒转化到大肠埃希菌株BL21进行诱导表达,表达产物用Western blot鉴定,并经镍亲和层析法纯化及透析复性,得到的蛋白用微量细胞病变抑制法检测其抗病毒活性。结果显示,构建的载体经PCR扩增得到长度为2 118 bp的特异片段,测序结果证实与鸡Mx基因同源性99.95%,Western blot结果显示在78 ku处检测到特异性蛋白条带,微量细胞病变抑制试验结果显示,表达产物经8倍和256倍稀释后可分别保护50%鸡胚成纤维细胞免受新城疫病毒(NDV)和水疱性口炎病毒(VSV)的感染。结果表明,成功表达了鸡Mx蛋白,且表达产物具有一定的抗DNV和VSV活性。

PolyI∶C不同途径诱导大菱鲆Mx蛋白基因的转录

以PolyI∶C(又称聚肌胞)为诱导剂,分别通过腹腔注射、浸泡和投喂3种途径诱导大菱鲆Scophthalmus maximus体内抗病毒蛋白Mx基因的转录,利用半定量RT-PCR方法检测干扰素下游基因-Mx基因的转录水平来确定该诱导剂的诱导效果。结果显示,以上3种途径都能高效诱导Mx蛋白mRNA的转录,均在48h之后达到高峰,其中以浸泡的方式更容易诱导Mx基因转录,且在120h时仍保持较高水平。Mx基因转录的时相变化证明了国产PolyI∶C可以通过多种途径诱导抗病毒蛋白Mx的表达,为实际应用中确定用药途径提供了理论依据。另外,实验初步建立了半定量RT-PCR方法,为检测鱼体内干扰素的表达提供了技术方法。

牙鲆Mx基因的克隆及序列分析

对牙鲆(Paralichthys lethostigma)总RNA经反转录得到的cDNA测序。结果表明,获得的cDNA片段全长1 980 bp,其中编码区长1 890 bp,编码629个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为71.7 kDa。Blast比较以及Megalign软件分析的结果表明,此cDNA片段具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域;一个发动蛋白家族的典型结构特征序列及C端高度保守的Leu拉链结构区。进一步的序列比较与进化分析结果表明,牙鲆Mx基因与日本比目鱼等鱼类的同源性较高,同源性达75.1%-98.7%;而与哺乳动物的同源性相对较低,同源性达50.3%-55.1%。

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础。本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率。结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达。SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Mx在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础。

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物,应用逆转录 聚合酶链式反应(RT PCR)方法,从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA,回收纯化后克隆到pGEM TEasyVector系统的T载体上。重组子的序列分析表明:所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp,编码240个氨基酸,包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明,草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性,其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高,为87.1%。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220,构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx,并在大肠杆菌中获得高效表达,重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26.6%。Q sephroseFF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95.6%。

4个种属Mx蛋白抑制水疱性口炎病毒的研究

[目的]本试验旨在研究4个种属(猪、人、小鼠、牛)Mx蛋白抗水疱性口炎病毒(VSV)的活性,以揭示胞质定位Mx蛋白抗VSV活性的保守性。[方法]设计特异性引物,PCR扩增4个种属Mx蛋白的全长基因,构建真核表达质粒;PK-15细胞过表达重组质粒,Western blot或间接免疫荧光试验(IFA)检测4个种属Mx蛋白在PK-15细胞内的表达及分布;过表达Mx蛋白的PK-15细胞感染VSV,8或16 h后收样,分别用RT-q PCR、Western blot、IFA和噬斑减少试验来分析VSV的复制。[结果]成功克隆并表达了4个种属Mx蛋白的全长基因,且Mx蛋白大小正确;虽然猪Mx1蛋白和小鼠Mx2蛋白以棒状形式分布于细胞质中,而猪Mx2蛋白、人Mx A蛋白和牛Mx1蛋白以颗粒形式弥散分布于细胞质中,但4个种属Mx蛋白均能通过抑制VSV-G mRNA的转录、减少VSV-G蛋白的合成及降低子代病毒的滴度来显著抑制VSV的增殖。[结论]4个种属Mx蛋白都能显著抑制VSV在PK-15细胞中的增殖。

鳜鱼Mx蛋白全长cDNA的克隆和序列分析

Mx蛋白是一类由I型干扰素诱导表达的抗病毒蛋白。本研究以感染了鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)的鳜鱼为材料,提取肝脏总RNA,通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Mx蛋白基因的核心片段序列,再应用3’和5’快速扩增cDNA末端(RACE)方法PCR扩增Mx蛋白cDNA末端,最终获得鳜鱼Mx蛋白cDNA序列(GenBank登陆号:AY392097)。序列分析表明:鳜鱼Mx蛋白cDNA含有2391bp,其中编码区长1881bp,编码627个氨基酸残基,推测蛋白质分子量大小为7.15kDa。鳜鱼Mx蛋白具有脊椎动物Mx蛋白共有的结构特征:一个三联体GTP结合区域(GXXXSGKS/T、DXXG、T/NKXD);一个发动蛋白家族的典型结构特征序列(LPRGS/KGIVTR);以及C端高度保守的Leu拉链结构域。鳜鱼Mx蛋白全基因的获得为下一步研究鱼类Mx蛋白的抗病毒活性、作用机制,以及干扰素的检测奠定了基础。