牡蛎共生菌Myceliophthora lutea ML-1发酵液的化学成分研究

为研究牡蛎共生菌Myceliophthora lutea ML-1发酵液的化学成分,采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、C18反相柱层析、高效液相色谱等方法对M.lutea ML-1发酵液粗浸膏进行分离纯化;采用高分辨质谱、核磁共振谱等现代波谱技术及文献比对方法鉴定化合物结构,并基于LC-MS/MS分子网络分析M.lutea ML-1发酵液粗浸膏的化学成分。结果表明:从M.lutea ML-1发酵液中分离到5个化合物,即3-methoxy-5-pentadecylphenol(1)、3-methoxy-5-heptadecylphenol(2)、3-methoxy-5-nonadecylphenol(3)、3-methoxy-5-heneicosylphenol(4)和尿嘧啶(5)。分子网络分析显示,M.lutea ML-1发酵液富含多种类型化学成分;除间苯二酚类化合物外,还含有环二肽、酰胺、吲哚等生物碱。综上,从牡蛎共生菌M.lutea ML-1中分离得到的化合物1-4为5-烷基-3-甲氧基苯酚化合物,分子网络分析结果为后续化合物的导向分离提供了思路。

基于液相色谱-串联质谱分子网络的牡蛎共生真菌Myceliophthora lutea ML-1发酵液的化学成分分析

目的基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分子网络技术分析牡蛎共生真菌Myceliophthora lutea(M.lutea)ML-1发酵液的化学成分,以明确其次生代谢产物谱。方法将M.lutea ML-1使用真菌1号培养基进行发酵,发酵液粗浸膏的LC-MS/MS原始数据经MSconvert软件转换为.mzXML格式文件,再上传至全球天然产物社会分子网络(GNPS)平台构建经典分子网络(CMN),进行化学成分识别和结构预测。将原始质谱数据经MZmine 2软件预处理后上传至GNPS平台构建特征峰分子网络(FBMN)。将CMN和FBMN分别导入Cytoscape软件进行可视化分析。结果基于CMN,从M.lutea ML-1发酵液中识别出49个化合物,包括18个脂肪酸类化合物、8个蒽醌类化合物、12个环二肽类化合物和11个其他类化合物,其中可能有2个新二蒽醌类化合物。基于FBMN进行发酵液化学成分的相对定量分析,目前已识别出其中的3个化合物。结论M.lutea ML-1真菌1号培养基发酵液的化学成分丰富,其中不乏极具潜力的活性化合物,可为后续化学成分的导向分离和菌株发酵条件优化提供思路。

Myceliophthora thermophila漆酶与木质素模型物的对接研究

漆酶催化木质素氧化聚合或降解是自然界碳循环的重要环节,其作用机制一直是生物质科学领域的研究热点.文中采用分子模拟技术进行研究,首先构建Myceliophthora thermophila(Mth)漆酶的3D模型,然后用9种木质素模型物在Mth漆酶T_1Cu口袋区做分子对接.结果表明,Mth漆酶中4个Cu离子与高度保守的4个氨基酸片段结合,Mth漆酶与Melanocarpus albomyces漆酶亲缘关系最近(Identity值>74%),以之为模板可得到高质量的3D模型,Ramachandran Plot分析证明模型中所有氨基酸构象都是合理的.在Mth漆酶T_1Cu活性口袋区,木质素单体与Ala192、Lys188和Trp507氢键结合,脂肪链端羧基化会影响Trp507形成氢键,若酚羟基邻位被双甲氧基取代,则会降低单体的结合能.木质素模型物聚合度越高,结合能越低,二者线性相关.由于空间位阻效应,四聚体不能进入活性口袋,需要介体才能被Mth漆酶催化氧化.

水热预处理与Myceliophthora thermophila复合酶协同高效降解混合生物质的研究

以甘蔗渣-棉杆-小麦秸秆(4∶2∶1,质量比)混合生物质为研究对象,考察了水热预处理参数对混合生物质中各组分含量的影响,研究了嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)复合酶(MTE)与纤维素酶(Cel)协同作用下水热预处理混合生物质的酶解效率,并对酶解液及酶解渣分别进行UV、FTIR分析。结果表明,水热预处理温度是影响混合生物质中各组分含量变化的主要因素,在相近水热预处理强度下,经150℃维温30 min和180℃维温5 min处理的混合生物质中木质素含量分别为(26.50±1.33)%和(29.40±1.35)%。MTE对Cel具有明显的协同作用,且受水热预处理温度的影响较大。MTE对经160℃维温10 min处理的混合生物质的Cel酶解协同效率最高达(53.60±2.68)%,酶解总糖得率达(75.50±3.77)%;而继续升高温度或者延长维温时间,虽然酶解总糖得率略有升高,但MTE的协同酶解效率快速降低。UV和FTIR分析表明,MTE所含的木质纤维素分解酶和木质素氧化酶可在较低预处理强度下协同Cel提高混合生物质的酶解效率。

Phylogeny of the industrial relevant,thermophilic genera Myceliophthora and Corynascus

Species of the genus Myceliophthora and its teleomorph Corynascus have attracted increasing interest due to their potential to produce thermostable enzymes.This study re-assessed the phylogenetic relationship of 49 isolates of nine species belonging to Myceliophthora and Corynascus.One species,M.vellerea,was shown not to belong to the genus Myceliophthora and should be placed in the genus Ctenomyces.The other species belonged to two phylogenetic clusters:mesophilic fungi with the type species M.lutea and C.sepedonium,and thermophilic fungi with M.thermophila,M.hinnulea and C.thermophilus.The phylogenetic data provides no clear separation of the two genera Corynascus and Myceliophthora.To avoid confusion in future taxonomic studies,it is proposed that all existing Corynascus species be renamed to Myceliophthora,which is the old name and the one more frequently used.Furthermore,this study identified two groups within the isolates listed as M.thermophila and assigned one group(five isolates)to M.heterothallica based on AFLP analysis and mating behavior.This study provides new insights into the genetic differences within the genus Myceliophthora and will therefore be essential for the interpretation of future genomic and physiological studies of these species.

中国毁丝霉属嗜热型真菌两新记录种

对在山东、陕西及云南采集的标本进行了研究 ,鉴定出毁丝霉属 (MyceliophthoraCost)中的 2个嗜热型真菌新记录种 ,即弗格斯毁丝霉 [M .fergusii(vanKlopotek)vanOorschot]和嗜热毁丝霉 [M .thermophila (Apinis)vanOorschot],并对其进行了描述和讨论。凭证标本保存在山东农业大学植物病理学标本室 (HSAUP)。

产纤维素酶金孢与毁丝霉菌株的筛选及温度对其产酶的影响

为筛选产纤维素酶较高且耐热的菌株,以18株金孢和毁丝霉属菌株为研究对象,同时还研究了温度对这些菌株产纤维素酶的影响。结果表明:这些金孢和毁丝霉属的供试菌株都能不同程度地产纤维素酶。其中,菌株H127-1是产纤维素酶最高、酶组分最合适且耐热的菌株。此外,在一定温度范围内,高温能促进金孢和毁丝霉属菌株产纤维素酶。

一株嗜热毁丝霉菌株产纤维素酶条件优化

以一株嗜热的毁丝霉H127-1为出发菌株,对其产纤维素酶的液体发酵条件进行了研究。结果表明,最佳碳源为稻草粉,最佳氮源为黄豆粉。当添加一定量的金属离子时,Fe2+能显著促进H127-1产CMC酶以及β-葡萄糖苷酶,而Zn2+和Cu2+则极大地抑制了其产酶;Ca2+、Ba2+和Mg2+都能促进H127-1产CMC酶,但在一定程度上抑制了其β-葡萄糖苷酶的分泌。发酵液初始pH值、装液量、接种量、发酵时间对H127-1的产酶也有一定影响,最适宜条件为初始pH4、装液量30～50 mL/250 mL、接种量6%～8%、最佳发酵时间为2～4 d。

中国大陆嗜热真菌2新记录种

从采自海南的标本中分离到2个中国大陆新记录种——嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)和黄褐毁丝霉(Myceliophthora hinnulea),并进行了形态学描述。研究标本保存于山东农业大学植物病理学标本室(HSAUP)。

干扰MHR1对嗜热毁丝霉纤维素酶活性的影响

利用RNA-Seq技术,筛选到潜在的负调控因子MHR1(fungal_TF_MHR1).为研究MHR1与纤维素酶基因表达之间的关联,设计基因mhr1的RNA干扰序列,并使用丙酮酸脱羧酶强启动子pdc成功构建mhr1基因的RNA干扰表达载体,经原生质体转化,获得一株干扰效率较高的阳性转化子MtR5.通过RT-q PCR、酶活测定和胞外蛋白浓度测定等分析发现,在诱导和非诱导培养条件下,转化子MtR5的胞外蛋白浓度、纤维素酶活性以及主要纤维素酶基因的表达量均高于野生型的.干扰转录因子MHR1可增加纤维素酶基因的表达量,研究表明,MHR1是一种与纤维素酶基因表达调控相关的转录因子.

同源过表达mhr2基因可提高嗜热毁丝霉纤维素酶活性

为寻找新型的与纤维素酶相关转录调控因子,以嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila ATCC42464)为研究材料,通过克隆嗜热毁丝霉mhr2基因序列,构建重组过表达载体,转化并筛选到转化子Mt O24中mhr2基因表达量比野生型菌株高204倍。蛋白浓度及酶活测定的结果显示,诱导培养72 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.58和1.30倍;非诱导培养144 h,转化子胞外蛋白浓度和滤纸酶活分别是野生菌的1.87和1.49倍。实时荧光定量PCR的结果表明,转化子中主要纤维素酶基因egl1、egl3和cbh1、cbh2的表达量均有显著提高。研究初步证实了mhr2基因具有调控纤维素酶基因表达的功能。

嗜热毁丝霉高通量培养技术及其应用

【背景】丝状真菌是一类重要的工业发酵生产宿主菌,如何进行高通量纯菌培养和高效检测筛选性能优异的菌株是工业丝状真菌研究的重要方向。【目的】研究建立丝状真菌的高通量培养技术并测试应用效果。【方法】通过对丝状真菌培养过程中的制种、接种、培养和检测研究,建立基于孔板的高通量培养技术,并以嗜热毁丝霉为例对该技术进行验证。【结果】与传统的平板制种和摇瓶接种培养方式相比,高通量孔板的培养方式将制种通量提高24倍,单位面积产孢子能力提高350%,液体培养转接效率提高10−40倍,并建立96孔板测定乙醇含量的高通量检测技术。【结论】将丝状真菌的培养和检测通量提高1−2个数量级,为快速检测丝状真菌改造过程产生的大量性状不同菌株并获得目标菌株奠定基础,为丝状真菌高通量筛选研究提供应用指导价值。

降解棉秸秆耐热菌株的鉴定及降解条件优化

【目的】鉴定从新疆棉花秸秆高温堆肥中分离出的两株耐热真菌Z1、Z2的属种,并通过优化影响菌株产生纤维素酶的因素来提高菌株对秸秆的降解率。【方法】经形态学和菌株的ITS区克隆与序列分析确定属种,以液体摇瓶发酵产滤纸酶活性(FPA)变化为衡量指标,对Z1、Z2以及二者混合菌(MS)的纤维素酶产生条件进行优化。【结果】菌株Z1为曲霉属烟曲霉(Aspergillus fumigatus Fresen),Z2为蚀丝霉属(Myceliophthora Cost.)。确定Z1以棉秸秆为碳源、以NaNO3为氮源、起始pH 9.5、接种量11%、50°C摇床培养10 d,对棉秸秆降解率为10.19%;Z2以麦秸秆为碳源、以NaNO3为氮源、起始pH 5.5、接种量9%、50°C摇床培养10 d,对麦秆降解率为27.50%;MS以棉花秸秆为碳源、以蛋白胨为氮源、起始pH 5.5、接种量11%、50°C摇床培养10 d,对棉秸秆的降解率为53.45%。【结论】实验表明,MS(Z1、Z2混合)对秸秆的降解效果优于单株菌,降解率达到一半以上,本研究中的两株耐热真菌在降解棉花秸秆、小麦秸秆等农作物废弃秸秆中具有较高的应用价值。