分枝杆菌甾酮C_(1,2)位脱氢酶基因敲除的研究

利用分枝杆菌对植物甾醇进行边链降解可产生4-AD(4-烯-雄甾-3,17-二酮)和ADD(1,4-二烯-雄甾-3,17-二酮),ADD由4-AD在C1,2位脱氢酶(ksdD)作用下脱氢产生,这两种物质在化学结构上高度相似,难以分离。首先扩增出部分ksdD基因,大小为631bp,并以此为基础构建打靶载体pUC19-MK。将pUC19-MK电转分枝杆菌感受态,通过同源重组敲除分枝杆菌染色体上正常的ksdD基因,使C1,2位脱氢酶失活,以达到4-AD大量积累的目的。结果通过初筛筛选出5株转化子,进行甾体转化实验,发酵144h时,1号转化子的4-AD生成率达到17.52%,比出发菌株提高了192%,而此时ADD的生成率仅为6.12%,比出发菌株降低了89.9%。