Mycobacterium sp.LY-1高效转化植物甾醇两相体系的构建

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种卤代皮质类激素的重要前体,具有重要的商用价值.为进一步提高目的产物9α-OH-AD的产量,在本实验室前期利用非离子表面活性剂壬基酚乙氧乙烯醚(TX-40)替代大豆油进行Mycobacterium sp.LY-1转化植物甾醇的基础上,通过考察16种助溶剂与TX-40复配对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响,确定最适助溶剂为司盘-20.通过正交优化实验确定司盘-20的最优添加浓度为0.1%.进一步考察不同浓度细胞膜结构抑制剂甘氨酸、鱼精蛋白、异烟肼对菌株LY-1转化植物甾醇的影响,结果显示在以上转化体系中添加1.0μg/mL的鱼精蛋白时,9α-OH-AD的摩尔得率最高,达到46.4%.最终确定菌株LY-1降解植物甾醇的两相转化体系为TX-400.7%,司盘-200.1%,鱼精蛋白1.0μg/mL.该体系于植物甾醇的投料浓度提高至35 g/L时,目的产物9α-OH-AD的摩尔得率仍能稳定在32.5%以上.本研究成功构建了Mycobacterium sp.LY-1高效转化植物甾醇的两相体系,结果可为其工业化应用奠定良好基础.(图4表2参26)

分枝杆菌Mycobacterium ZLP生产雄烯二酮(4-AD)的优化工艺

利用正交实验对分枝杆菌降解植物甾醇生产雄烯二酮(4-AD)的发酵培养基进行优化,同时进行温度和pH的优化。结果表明:培养基的最佳组成为质量分数2.0%葡萄糖、2.0%蛋白胨、0.7%MgSO4、0.8%K2HPO4;最适温度28℃、最适pH 7.0,在此基础上发酵96 h,4-AD的产率可达到62.15%。

不同NaCl含量、培养基和微量元素对分枝杆菌SP-3降解菲的影响研究

研究了分枝杆菌SP-3在不同Na Cl含量、培养基和微量元素中降解菲的效果影响。结果表明,分枝杆菌SP-3在Na Cl质量分数为1%时对菲的降解率达到最大,为87.41%;菌株在LB液体培养基、改良LB液体培养基和改良的无机盐液体培养基中对菲的降解率都达到了80%以上,三者之间无显著性差异;Fe2+、Zn2+浓度分别在100μmol/L和5μmol/L,Mg2+在100μmol/L时,可以提高菌株对菲的降解能力,而Cu2+随着浓度的增加,能够抑制菌株对菲的降解。研究结果有助于该菌应用于多环芳烃降解的生物技术中,以提高菌株对菲等多环芳烃的降解能力。

结核杆菌耐热抗原对A549细胞分泌SP-B和凋亡的影响

目的探讨结核杆菌耐热抗原(Mtb-HAg)刺激诱导人肺腺癌细胞系(A549)细胞后对其肺泡表面活性物质相关蛋白B(SP-B)的分泌和凋亡的影响。方法用不同浓度的Mtb-HAg分别刺激诱导A549细胞,相同条件分别培养24、48 h,同时设置空白对照组(对照组1和对照组2)和阳性对照组[脂多糖(LPS)组和姜黄素组]。运用ELISA法检测对照组1、LPS组和实验组1(2、3μg/ml Mtb-HAg分别诱导A549细胞培养24 h和48 h)培养上清液中的SP-B表达量;使用实时荧光定量PCR法检测对照组1、LPS组和实验组1中基因SFTPB的相对表达量;采用流式细胞技术检测对照组2、姜黄素组和实验组2(2、3μg/ml Mtb-HAg分别诱导A549细胞培养24 h)中A549细胞的凋亡率。结果刺激诱导相同时间,实验组1的SP-B表达量低于对照组1,差异有统计学意义(P<0.05);相同浓度刺激诱导随时间的延长,实验组1中SP-B表达量降低的不显著。相同培养时间,随着Mtb-HAg浓度的增加实验组1表达SP-B的基因SFTPB的相对表达量显著低于对照组1,差异有统计学意义(P<0.05);而在相同有效刺激浓度下,其相对表达量随作用时间变化不显著。姜黄素组和实验组2中的A549细胞凋亡率显著高于对照组2(P<0.05)。结论 Mtb-HAg对A549细胞表达SP-B的抑制作用明显,并能诱导A549细胞发生凋亡。

菜籽甾醇转化制备雄烯二酮高产菌株的诱变育种

以分枝杆菌Mycobacterium sp.BD-696为出发菌株,采用紫外、硫酸二乙酯复合诱变处理,筛选得到两株雄烯二酮高产突变株:Mycobacterium sp.BD-696-3和Mycobacterium sp.BD-696-6,在底物甾醇添加量为6‰、摇瓶发酵168h时的雄烯二酮产量分别为2.31g/L和2.33g/L,得率分别为60.7%和61.4%,较出发菌株提高了12.8%和13.5%。连续传代实验结果表明,突变株Mycobacterium sp.BD-696-6的遗传性状稳定。

微生物生物转化甾体化合物生产雄烯二酮研究进展

雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)是甾体激素类药物重要的中间体,目前以微生物植物甾醇生物转化生产AD(D)是研究的热点,综述了微生物生物转化植物甾醇生产雄烯二酮的研究进展。

一株耐碱性芘降解菌的筛选及特性研究

以长庆油田油井口附近的土壤为材料,芘为唯一碳源和能源的BH培养基中分离到一株高效芘降解菌株b2,经形态学观察和16SrDNA测定,将其鉴定为分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)。研究发现,在培养温度为37℃、转速为175r/min,培养起始pH 10,接种量为2.0%时菌体生长较快。最佳培养条件下,在芘质量浓度为250mg/L的BH培养基中,经菌株b2降解4d后质量浓度下降76%。说明培养条件对菌株的生长和芘降解速度有明显的影响。

诱变选育雄烯二酮高产菌株及其发酵条件研究

以一株降解植物甾醇产生雄烯二酮的分枝杆菌为研究对象,先后利用亚硝基胍(NTG)和N+注入技术对其进行诱变处理。通过考察NTG浓度和N+注入剂量对菌株诱变效果的影响,确定了最佳诱变条件为NTG浓度为0.6 mg/mL,N+注入剂量为60×1011ions/cm2。最终选育出一株高产突变株Mycobacterium sp.N-2,其生产雄烯二酮的能力较出发菌株提高了37.8%,且传至第七代仍基本稳定。进一步研究了初始pH值、接种量和摇床转速等对高产突变菌株发酵能力的影响,确定了最佳发酵条件为初始pH值7.5,接种量12%,摇床转速260 r/min。

反应介质对植物甾醇侧链生物降解的影响

分析考察了有机溶剂、表面活性剂和超分子等反应介质对分枝杆菌(Mycobacterium sp.NRRLB-3683)降解植物甾醇生成雄甾烯酮AD(D)的生物转化反应的影响.结果表明,采用有机溶剂和吐温80等表面活性剂作为反应介质的转化反应的转化率较低,而在含有环糊精的超分子反应介质中植物甾醇的转化率和转化速率均大幅度提高.采用直接添加的方式加入羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD),反应168h,植物甾醇转化率达89.8%,比对照提高了2.9倍.转化48h时加入与植物甾醇摩尔比为2∶1的HP-β-CD,72h时转化率达到87.5%,此时同期对照转化率为27.6%,缩短了反应周期.

β-谷甾醇侧链的微生物降解

选用一株分枝杆菌(Mycobacterium sp.)限制性降解β-谷甾醇获得产物雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)。研究了培养基成分对产物产率的影响,在最佳pH 7.0,添加磷酸盐的条件下,得到了最高产率为89%。对β-谷甾醇的添加方式、添加量和补加时间的研究表明提高β-谷甾醇的有效反应浓度是提高转化效率的关键。

一株分支杆菌的产油特性

从炼油厂废水中分离出一株产油细菌QJ3011,经16S rDNA片段序列分析证实该菌归属于Mycobacterium属。通过透射电镜观察发现该菌在采用限氮培养基培养时可在细胞内形成脂质内含体,通过脂肪酸组成分析证实这些储备脂质是甘油三酯。该菌将各种碳源转化为微生物油脂的效率差异较大,其中葡萄糖和甘油是两种转化效率较高的碳源,而蔗糖和柠檬酸钠则转化效率较低。

分支杆菌降解大豆甾醇侧链的发酵研究

对分支杆菌(MycobacteriumspJY 1)降解大豆甾醇(BS)侧链至4 烯 雄甾 3,17 二酮(4 AD)和1,4 二烯 雄甾 3,17 二酮(ADD)的培养基组成、种子培养时间、通气量、投料方式及时间等发酵条件进行了研究。在投料浓度为0.3%,转化时间为168h的条件下,使4 AD(D)的转化率由原来的37%提高到50%左右。

固定化分枝杆菌BD696-6产雄烯二酮发酵条件的研究

利用海藻酸钙凝胶颗粒将分枝杆菌BD696-6固定,进行固定化细胞的发酵条件研究。实验结果表明:发酵最适条件为:pH8.5、温度32℃、底物浓度0.5%、转化时间144h,较游离细胞发酵周期缩短了24h,雄烯二酮产量明显提高,得率均在78%以上,且固定化细胞的贮藏稳定性、重复使用效果较好。电镜扫描结果显示以海藻酸钙为包埋载体时,营养物质可自由传输。

邻苯二甲酸酯降解菌的筛选、降解特性及土壤修复研究

为寻找高效邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)降解菌,采用富集培养法从城市污水处理厂活性污泥中分离筛选出一株DEHP降解菌并命名为ASW6D。通过扫描电镜、16S r RNA同源性序列分析,初步将菌株ASW6D鉴定为分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)。菌株ASW6D可在较宽温度(20~40℃)和pH(5~10)范围下高效降解DEHP,其最适生长降解条件为30℃、pH 8.0,3 d内可将初始浓度为500 mg·L^(-1)的DEHP降解82.87%。进一步采用GC-MS分析DEHP降解的中间产物,推测出DEHP的生物代谢途径为先通过β-氧化缩短DEHP侧链,生成邻苯二甲酸二丁酯(DBP),再将DBP转化为邻苯二甲酸(PA)。将菌株ASW6D接种到DEHP污染的土壤,可将土壤中DEHP去除率提高58.67%,表明ASW6D在PAEs污染环境生物修复方面的应用具有一定的潜力。

双水相体系中分枝杆菌降解植物甾醇制备雄甾-4-烯-3,17-二酮

雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)是合成多种甾体药物的重要中间体,可通过分枝杆菌选择性降解植物甾醇侧链制备得到,但该过程中存在底物溶解度低及产物AD对微生物细胞的毒害性等问题。在双水相体系中研究了分枝杆菌降解植物甾醇生产AD的过程,测定了细胞和产物AD在聚合物/聚合物、聚合物/盐双水相体系中的分配系数,考察了不同分子量的聚乙二醇对分枝杆菌的毒性以及添加表面活性剂、溶氧量等对产物AD的影响,研究了高底物投料浓度下的转化情况,并进行了初步放大实验。结果表明,在组成为聚乙二醇6000(7%(wt))/葡聚糖70000(8%(wt))的双水相体系中,AD主要分布在富含聚乙二醇的上相,而细胞则主要分布在富含葡聚糖的下相。对规模为200 g的双水相体系,在吐温40添加量1%(V/V)、转速240 r×min^(-1)的优化条件下,将植物甾醇投料浓度提高到10 g×L^(-1)、发酵96 h后AD的浓度达到1.1 g×L^(-1)。双水相体系具有良好的生物相容性,可应用于分枝杆菌降解植物甾醇萃取发酵生产AD,有效缓解了在转化过程中存在的产物抑制作用,具有潜在的工业应用前景。

β-环糊精对甾体微生物转化菌种生长特性的影响

研究了β-环糊精(简称β-CD)对两种甾体生物转化菌种蓝色犁头霉(Absidia coerulea)和分枝杆菌(Myco- bacterium sp．)生长特性的影响。采用以β-CD作为唯一碳源的固体培养法和添加有β-CD的液体培养法,分别观察菌种对β-CD的利用以及β-CD对菌体生长过程和生物量的影响。结果表明,两种菌种均不能利用β-CD;在培养液内添加不同量的β-CD或在菌体生长的不同时期添加一定量的β-CD均不影响菌种的生长特性。

曲霉3277次级代谢产物中抗结核活性成分研究

目的研究曲霉3277次级代谢产物中抗结核活性成分。方法通过DIAION HP20大孔树脂吸附、Toyoperal HW-40F凝胶以及硅胶柱层析,结合生物自显影,对曲霉3277发酵液中的抗结核分枝杆菌活性成分进行分离,采用NMR、ESI-MS技术鉴定其结构,并采用MABA方法,对结核分枝杆菌H37Rv最低抑制浓度(MIC)进行测定。结果分离得到了3个化合物,分别命名为3277-1、3277-2、3277-3。其中的一个化合物3277-2的结构为:4-((1Z,3Z)-2,3-二异腈基-4-(4-甲氧基苯基)1,3-丁二烯)硫酸苯酯钠。3277-2对结核分枝杆菌H37Rv的MIC为8μg/ml。结论3277-2为新化合物,体外具有明显的抗结核活性。

响应面法优化游离细胞法生产雄烯二酮初探

采用响应面法对游离细胞法生产雄烯二酮工艺进行了优化。首先利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响雄烯二酮转化率的3个主要因素:植物甾醇浓度、羟丙基-β-环糊精浓度、菌体量。在这个基础上用最陡爬坡法来逼近最大响应值范围,然后利用响应面分析法确定这几个主要因子之间的交互作用和最佳条件。结果表明,当植物甾醇浓度为19.41 g/L,羟丙基-β-环糊精浓度为80.14 g/L,菌体浓度为110.55 g/L,雄烯二酮最大转化率可达67.25%,与响应面预测转化率相近,与优化前相比,雄烯二酮转化率提高了41.55%,雄烯二酮含量达8.68 g/L,生产强度为2.17 g/(L·d)。

含深共熔溶剂体系中晶胶微球固定化分枝杆菌生产雄烯二酮研究

分枝杆菌全细胞催化的选择性植物甾醇侧链降解反应可用于生产甾体药物重要中间体雄烯二酮(AD),由于存在底物低水溶解度和产物抑制与降解等问题,该反应的转化效率较低。深共熔溶剂(DESs)是一种新型的绿色溶剂,可以作为助溶剂有效促进底物溶解。本研究在甜菜碱(Bet)与麦芽糖(Mal)或半乳糖(Gal)组成的2种DESs构成的转化体系中,以甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸正丁酯聚合的晶胶微球为基质,研究了固定化分枝杆菌细胞降解植物甾醇侧链生产AD的过程。结果表明:晶胶微球能够有效分散细胞,提高了细胞利用率,固定化后单位细胞AD产量提高了6.8倍。DESs可缓解AD降解和减少AD在晶胶微球内的累积,经过3批次半连续转化后,在含10%体积分数Bet/Mal体系中的单位细胞干重(DCW)的总AD产量可达401.4 mg/g,是缓冲液体系悬浮培养细胞的12倍。在含DESs体系中晶胶微球固定化分枝杆菌能促进植物甾醇降解从而提高AD产量,具有潜在的工业应用前景。

分枝杆菌LY-1转化植物甾醇产9α羟基雄烯二酮的发酵工艺优化

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可用于糖皮质激素类药物的生产。为了提高目的产物的产量,以分枝杆菌(Mycobacterium sp.) LY-1作为出发菌株,研究不同碳源、氮源、磷酸盐和金属离子等培养基组分对菌株LY-1转化植物甾醇生产9α-OH-AD的影响,结合正交试验优化,确定最适培养基组分为玉米浆30 g/L、KNO_3 4.0 g/L、NaH_2PO_4 1.2 g/L、FeSO_4 0.075 g/L及CaCl_2 0.10 g/L。在此条件下,当植物甾醇投料质量浓度为15 g/L时,产物得率达到43.9%～44.9%。通过单因素实验优化培养条件,得到最适培养条件为pH 8.0、接种量2%、温度30℃时,9α-OH-AD的得率可达46.2%～47.0%,比优化前提高了22.1%,产量达到5.21 g/L,具有潜在的工业应用价值。