结核分枝杆菌复合群、副结核分枝杆菌和禽分枝杆菌禽亚种多重TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用

结核分枝杆菌复合群(MTBC)、包括结核分枝杆菌(MTB)、牛分枝杆菌(MB)、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌等;非结核分枝杆菌(NTM)中禽分枝杆菌(MA)是自然界常见的动物致病菌,包含4个亚种,分别为禽分枝杆菌禽亚种(MAA)、禽分枝杆菌人/猪亚种(MAH)、禽分枝杆菌副结核亚种/副结核分枝杆菌(MAP)和禽分枝杆菌森林土壤亚种(MAS)。为建立MTBC、MAP和MAA的多重荧光定量PCR检测方法,本研究基于MTBC、MAP和MAA的特异性基因devR、F57和IS901分别设计引物及探针,通过优化各反应条件,建立了一种可同时检测3种分枝杆菌的多重Taq Man荧光定量PCR方法。特异性试验结果显示,该方法对MTB、MB、MAP、MAA和MAS检测为阳性,对其他畜禽病原菌,包括MAH、13种NTM和7种非分枝杆菌检测结果均为阴性,特异性较强。敏感性试验结果显示,该方法对MB、MAP和MAA重组质粒标准品的检测限均为1.0拷贝/μL,敏感性较高;重复性试验结果显示,批内与批间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法检测体外模拟污染(MB、MAP和MAA菌液浓度分别为1.0×10^(3)cfu/mL~1.0×10^(0)cfu/mL)的27份牛抗凝血和12份牛淋巴结组织样品,确定该方法对3种菌的检测限,结果显示该方法对3种菌的检测限均为1.0 cfu/mL~10.0 cfu/mL。将浓度为1.0×10^(6)cfu/mL的MB、MAP和MAA菌液分别单一、两两混合、三种菌混合感染BALB/c小鼠,5 d后,剖杀各组小鼠并取各组织及血液样品,同时采用该方法、常规单一PCR及细菌分离培养方法检测,比较三者的检测结果。结果显示,多重荧光定量PCR方法对不同感染组小鼠的各组织样品检出率为98.1%(212/216),常规单一PCR方法的检出率为81.5%(176/216),细菌分离培养的检出率为52.8%(114/216),多重荧光定量PCR与常规单一PCR的阳性符合率均为100.0%(176/176),与细菌分离培养鉴定结果的阳性符合率均为100.0%(114/114)。本研究首次建立了能够同时检测MTBC、MAP和MAA的Taq Man多重荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性及稳定性好,检测性能强,可以用于临床各种样品的检测,为这3种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。

建立基于gyrB基因检测结核分枝杆菌复合物的荧光定量PCR法

目的建立基于gyrB基因扩增检测结核分枝杆菌复合物(MTC)的荧光定量PCR(FQ-PCR)法。方法根据gyrB基因设计合成引物和探针,建立并评价TaqMan探针FQ-PCR法,并与基于IS6110序列的FQ-PCR法分别检测50例临床标本,比较两种方法的检测结果。结果建立的FQ-PCR法标准曲线方程为Y=-3.18X+42.84,相关系数(r2)为0.995、扩增效率为106.25%,其检测灵敏度为102CFU/mL;MTC中结核分枝杆菌和非洲分枝杆菌阳性,其他分枝杆菌和4株临床其他细菌均为阴性。批内及批间变异系数(CV)均<2%,重复性良好。本法与基于IS6110序列的FQ-PCR法对50例临床标本的检测结果差异无统计学意义(χ2=0.06,P>0.05),一致性好(κ=0.94)。结论基于gyrB基因扩增的FQ-PCR法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于结核分枝杆菌复合物的早期快速诊断。

结核PCR定量测定在结核病诊断中的应用

目的:评价荧光定量PCR技术在结核病诊断中的应用价值。方法:采用荧光定量PCR(FQ-PCR)、涂片法和培养法同时检测580例结核患者、疑似结核患者的痰、胸腹水、脑脊液标本,对检测结果进行比较。结果:荧光定量PCR检测阳性率要高于涂片法和培养法的阳性率,统计分析有显著性(P<0.01)。结论:应用荧光定量PCR方法检测结核杆菌,具有特异、灵敏、简便、快速的特点,可作为结核病诊断的常规方法。

Gene Xpert MTB/RIF检测早期诊断结核性脑膜炎

目的评估Gene Xpert MTB/RIF检测在临床早期诊断结核性脑膜炎中的应用价值。方法选取2015-10—2017-03内蒙古自治区第四医院收治的86例临床诊断为结核性脑膜炎患者及同期32例非结核脑膜炎患者,对所有患者行Gene Xpert MTB/RIF检测、实时荧光定量PCR、脑脊液抗酸染色及脑脊液结核杆菌培养试验检测,观察各种检测方法患者阳性检出率,计算各检测方法敏感度、特异性及符合率等指标。结果脑脊液Gene Xpert MTB/RIF检测的敏感度、特异性、符合率、阳行预测值及阴性预测值分别为69.9%(60/86)、100%(32/32)、77.9%(92/118)、100%(60/60)、55.2%(32/58),符合率高于其他3种检测技术,与抗酸染色涂片及结核分枝杆菌培养比较差异有统计学意义(P<0.05);脑脊液Gene Xpert MTB/RIF检测具有较好的诊断价值(Kappa=0.792,P<0.01)。结论相对于抗酸染色涂片、结核分枝杆菌培养以及FQ-PCR,Gene Xpert MTB/RIF检测法在诊断TBM方面有更为显著的优势,能够有效帮助临床医生对疑似TBM的患者进行早期诊断。

荧光定量PCR方法在结核分枝杆菌复合群检验中的应用价值

目的分析利用荧光定量PCR方法检测结核分枝杆菌复合群。方法选取2019年6月至2020年6月医院接收436例结核可疑患者共计470份临床样本(其中414份为肺内样本,56份为肺外样本),以实验室培养为金标准,分析荧光定量PCR法的检验结果,并观察荧光定量PCR方法检测结核分枝杆菌复合群的灵敏度与特异度。结果在414份肺内样本中,培养阳性共计60份,培养阴性共计354份,荧光定量PCR检测中灵敏度为97.8%,特异度为97.5%;在56份肺外样本中,培养阳性共计12份,培养阴性共计44份,荧光定量PCR检测中灵敏度为100.0%,特异度为94.4%。以本研究总样本的培养结果来看,荧光定量PCR检测中灵敏度为98.2%,特异度为97.2%。结论荧光定量PCR方法在结核分枝杆菌复合群临床检验中具有较高的灵敏度与特异度,值得推广应用。