P1 gene of Mycoplasmapneumoniae in clinical isolates collected in Beijing in 2010 and relationship between genotyping and macrolide resistance

Background Mycoplasma pneumoniae is a common pathogen that caused community-acquired pneumonia （CAP）. P1 protein served as major adhesion and immunodominant protein in Mycoplasma pneumoniae, but little about P1 gene was learned and the relationship between P1 genotype and macrolide resistance has yet to be explored.

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中克隆的研究

在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段 ,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨羧基端基因片段功能打基础。采用PCR扩增方法获取P1结构基因。扩增产物用SalI和EcoRI酶切消化 ,回收 1kb大小的DNA片段并与 pUC19DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。用X gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株 ,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定。经PCR扩增MPDNA获得 1条 5 .0kbDNA片段。重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出 2条带 ,1条为pUC19载体DNA带 ,另 1条是 1kb的插入片段。实验获得肺炎支原体P1蛋白结构基因及含P1蛋白羧基端DNA片段的重组克隆株。

肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆与鉴定

目的 :在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,为实现肺炎支原体P1蛋白结构基因的大量扩增及表达奠定基础。方法 :PCR方法获取肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,并与 pUC19载体DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。X -Gal平板筛选转化子 ,用PCR方法和限制性核酸内切酶酶切图谱分析方法鉴定重组克隆。结果 :PCR和限制性核酸内切酶图谱分析均证实所获重组质粒中含有P1蛋白基因。结论 :获得了含有肺炎支原体P1蛋白结构基因的克隆菌株。

肺炎支原体P1蛋白结构基因片段的制备及C末端基因片段克隆的研究

目的 制备肺炎支原体P1蛋白结构基因 ,并在大肠杆菌中克隆肺炎支原体P1蛋白C末端基因片段 ,为P1蛋白基因片段的扩增、表达及探讨C末端基因片段功能打基础。方法 PCR扩增方法获取P1结构基因。扩增产物用P1蛋白基因特异引物扩增鉴定。用SalⅠ和EcoRⅠ双酶酶切消化方法制备P1蛋白C末端基因片段 ,并与pUC19DNA连接 ,转入大肠杆菌JM10 9菌株。用X - gal平板及质粒图谱分析方法筛选重组克隆株 ,再用限制性核酸内切酶酶切图谱分析鉴定。 结果 经PCR扩增MPDNA获得一条 5 .0kbDNA片段 ,用P1基因区特异引物扩增鉴定获得阳性结果。重组质粒限制性内切酶指纹图谱显示出两条带 ,一条为 pUC19载体DNA带 ,另一条是 1kb的插入片段。

STUDY OF ECK GENE EXON-3 FROM HUMAN NORMAL TISSUE AND BREAST CANCER CELL LINE

Objective To establish a method cloning the exon 3 of eck gene from normal tissue and ZR 75 1 cell line (a human breast cancer cell line)and study whether these genes exist mutant. Methods Designed a pair of specific primers and amplified the exon 3 of eck gene fragment from the extracted genomic DNA derived from normal epithelial cells from skin tissue and ZR 75 1 cell line respectively by PCR technique. Transformed the E.coil. JM109 with recombinant plamids constructed by inserting the amplified fragments into medium vector pUCm T and sequenced these amplified fragments after primary screening of endonuclease restriction digestion and PCR amplification. Results ① Obtained the genomic DNA of human normal epithelial cells and ZR 75 1 cell line respectively. ② Obtained the amplified fragments of human exon 3 of eck gene through PCR technique. ③ Obtained the cloning vectors of exon 3 of eck gene of human normal epithelial cells and ZR 75 1 cell line respectively. ④ ZR 75 1 cell line exists mutation of nucleotides. Conclusion Successfully established the method of cloning the human exon 3 of eck gene and found some mutations in the detected samples. This study lays a foundation for further studying the function of eck gene in tumorgenesis.

真核表达质粒pVAX1-Der p1的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建真核表达质粒pVAX1-Der p 1,检测质粒编码的重组蛋白在真核细胞293T中的表达,为进一步的动物实验打下基础。方法:分离屋尘螨总RNA,根据GenBank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,PCR扩增Der p 1编码基因,以其全长为目的基因,定向克隆至真核表达载体pVAX1,将其转化大肠杆菌DH5α,筛选含有重组质粒pVAX1-Der p 1的阳性克隆,培养后提取质粒并对其进行双酶切鉴定和序列测定及分析;应用Lipo-fectamine 2000脂质体转染剂,重组基因pVAX1-Der p 1和空质粒pVAX1分别转染真核细胞293T,采用细胞免疫荧光方法,以抗Der p 1特异性抗体检测质粒编码的重组蛋白在293T细胞中的表达情况。结果:获取的Der p 1基因与Genbank上Der p 1cDNA全长序列完全一致,且构建的表达载体实现了目的蛋白的表达。结论:我国本土屋尘螨Der p 1序列与GenBank已公布的核酸序列完全一致;成功构建含Der p 1全长序列的真核表达质粒pVAX1-Der p 1,其能在真核细胞成功表达重组蛋白。

肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段在大肠杆菌中的表达及应用研究

目的：克隆、表达和鉴定肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae,MP）P1蛋白羧基端基因序列,为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。方法在成功克隆肺炎支原体P1蛋白羧基端基因片段并测序的基础上,将基因序列克隆到表达载体pET32a（＋）上,构建了重组表达质粒pET32a（＋）/P1（3520~4563bp）,转化大肠杆rosetta,IPTG诱导表达,利用Ni2＋亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用ELISA和Western blotting方法检测其抗原性。重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,蛋白质纯度达95%以上。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。并成功获得两株高效价单克隆抗体。结论：本研究成功克隆和表达了肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,制备了抗肺炎支原体P1蛋白单克隆抗体,为肺炎支原体诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究奠定了基础。