人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体的表达和鉴定

目的对人源抗狂犬病毒G蛋白单链抗体A12进行可溶性表达及特异性和中和活性检测。方法表达人源单链抗体A12的菌株,经诱导后进行SDS-PAGE及Western blot检测,用流式细胞仪(FACS)检测表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染Vero细胞的能力,用快速荧光灶抑制实验(RFFIT)检测表达产物的中和活性。结果Western blot显示表达产物与抗C-myc抗体在相对分子质量约30 000处出现强阳性表达带。FACS表明A12与表达狂犬病毒G蛋白的重组痘苗病毒感染的Vero细胞出现特异性反应。RFFIT表明,A12 ScFv在1∶27倍稀释时能完全中和病毒。结论已获得了A12可溶性表达,表达产物能与狂犬病毒G蛋白特异性结合,并对狂犬病毒具有一定的中和活性。

狂犬病病毒糖蛋白膜外区表达及中和抗体间接ELISA检测方法的建立

采用RT-PCR方法克隆了狂犬病病毒CVS株G蛋白基因编码区,进而将完整编码区和膜外区编码基因分别克隆于pET-32a,将其中含膜外区编码基因的重组质粒pET-32a-PG转化BL21(DE3),经1.0 mmol.L-1IPTG诱导,外源基因获得高效表达。通过Western-blot以及ELISA试验证明表达产物具有良好的反应原性。以纯化后的表达产物作为抗原包被酶标板,用已知中和抗体效价的OIE参考血清对该方法进行了标准化,建立了检测狂犬病病毒中和抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被量为3.74μg,血清的最佳稀释度为1:100,待检血清阳性临界值为0.50。用此方法检测了418份血清样品,并与荧光抗体病毒中和试验(FAVN)方法进行了比较,符合率为98.61%。

微型双功能抗体介导人T细胞杀伤耐药实体瘤细胞

目的探讨抗P-糖蛋白(P-gp)/抗CD3微型双功能抗体介导人T细胞杀伤耐药实体瘤细胞的作用。方法采用抗E-tag亲和层析柱分离纯化抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;采用51Cr释放实验,测定抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体介导的人T细胞体外靶向杀伤活性;采用多药耐药(MDR)细胞系KB/MDR、敏感KB细胞裸鼠移植瘤模型,测定该微型双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性。结果纯化的抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体,在相对分子质量28 000和26 000处各有1条蛋白带。在抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体存在的情况下,激活的T淋巴细胞能够裂解KB/MDR细胞,且随着效靶比的增高而增高。抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体联合人T淋巴细胞能有效抑制KB/MDR细胞裸鼠移植瘤的生长,而对敏感KB细胞移植瘤的生长无抑制作用。结论抗P-gp/抗CD3微型双功能抗体在体内`外均能介导人T淋巴细胞杀伤表达P-gp抗原的KB/MDR细胞,是有望用于耐药实体瘤临床治疗的双特异性抗体。

抗髓鞘相关糖蛋白抗体的检测及相关周围神经病研究

目的研究抗髓鞘相关糖蛋白(myelin—associated glyeoprotein,MAG)抗体相关周围神经病的临床及电生理特点、抗体检测方法以及治疗和预后,以提高对该病的认识。方法总结2014年4月至2018年2月北京协和医院和山东大学齐鲁医院共6例抗MAG抗体阳性的IgM型单克隆丙种球蛋白血症相关周围神经病患者病例资料,对其临床特点、电生理特征、辅助检查结果包括抗MAG抗体检、狈0结果进行分析,并随访其治疗和预后。结果6例患者中,男性5例,女性1例,发病年龄50—77岁,病程3个月~6年。6例均以肢体远端麻木起病,渐发展至肢体近端受累,其中3例出现运动受累(肢体肌力Ⅲ~Ⅳ级)。5例出现行走不稳,双足踩棉感,1例伴下肢远端过电样疼痛。5例出现四肢腱反射减低,6例均有长手套、袜套样深浅感觉减退。5例患者行腰椎穿刺,脑脊液蛋白0.75~1.33g/L。6例患者均发现血清单克隆蛋白,其中4例为IgM K型,2例为IgG K和IgM K双克隆型。原发血液病诊断:4例诊断为意义未明的单克隆免疫球蛋白血症,2例诊断为巨球蛋白血症。6例患者均行肌电图检测,提示四肢多发性周围神经病,脱髓鞘损害,感觉神经损害为主,下肢重;2例针极肌电图可见自发电位,运动单位时限增宽、波幅增高,主动收缩募集减少,提示继发慢性轴索损害。6例均行基于转染细胞和动物周围神经组织的间接免疫荧光检测抗MAG-IgM抗体,结果均阳性。4例在确诊前给予激素以及静脉注射免疫球蛋白治疗,症状仍逐渐进展。确诊后3例行RCD(利妥昔单抗+地塞米松+环磷酰胺)化疗,1例好转[治疗前/后改良Rankin量表(mRS)评分为3/2分,随诊3年],1例平稳(治疗前/后mRS评分为2/2分,随诊2年),1例随诊中;1例给予利妥昔单抗治疗,病情好转(治疗前/后mRS评分为3/1分,随诊1年)。结论抗MAG抗体相关周围神经病临床表现为缓慢进展的远端对称性周围神经病,感觉受累为主,可合并运动受累,电生理符合脱髓鞘性周围神经病;其M蛋白类型多为IgM K型,问接免疫荧光检测血清抗MAG—IgM抗体阳性对于诊断可提供帮助,RCD化疗可改善周围神经症状。

嵌合锚定T淋巴细胞对肝癌细胞增殖的阻滞效应

目的探讨肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)靶向性嵌合锚定T淋巴细胞的制备方法,并检测它对TAG72阳性肝癌细胞增殖的阻滞效应。方法分离外周血单核细胞(PBMC),然后用免疫磁珠法分离得到CD8+T淋巴细胞。将重组真核表达载体anti-TAG72-scFv-CD28-pcDNA3.0采用脂质体介导的细胞转染和细胞培养,以制备TAG72靶向性的嵌合锚定T淋巴细胞;将嵌合锚定T淋巴细胞与TAG72阳性肝癌细胞SMMC7721共培养,通过流式细胞仪检测肝癌细胞的周期变化,分析嵌合锚定T淋巴细胞对肝癌细胞增殖的抑制效应。结果 TAG72靶向性嵌合锚定T淋巴细胞可识别肝癌细胞SMMC7721;用流式细胞仪检测发现,嵌合锚定T淋巴细胞可引起肝癌细胞SMMC7721的增殖阻滞。结论 TAG72靶向性嵌合锚定T淋巴细胞可特异性识别TAG72阳性肝癌细胞SMMC7721并引起其增殖阻滞。