猪Myl1基因启动子克隆及多态性研究

肌球蛋白轻链1基因(Myl1)编码的不同剪切体(主要是MLC1f和MLC3f)与哺乳动物骨骼肌肌纤维类型相关。通过猪BAC文库筛选及引物步行法测序获得Myl1基因的启动子序列,采用PCR-RFLP技术分析蓝塘猪、大花白猪、大白猪、长白猪和杜洛克猪5个品种Myl1基因启动子区的多态性。结果表明,Myl1基因-678C/T位点在蓝塘和大花白等本地猪种中多态性丰富,而在杜洛克、长白和大白等外来猪种中几乎只有CC基因型。

鹅MYL1基因的克隆及胚胎期表达特征分析

肌球蛋白是肌纤维的主要组成成分,在肌肉生长和收缩过程中具有重要作用.本研究以鹅(Anser anser)肌肉总RNA为模板,采用RACE的方法,克隆肌球蛋白轻链1(MYL1)基因全长cDNA序列,并进行生物信息学分析.运用实时荧光定量PCR检测MYL1基因在鹅胚胎期的表达特征.结果表明,鹅MYL1基因全长cDNA为1542 bp,编码193个氨基酸残基的肽链.预测鹅MYL1蛋白等电点5.12,分子量21.75 KD,具有典型的EFh和FRQ1结构域,且不同物种间EFh氨基酸序列高度同源.荧光定量PCR结果显示鹅胚胎期MYL1基因mRNA表达量总体呈现上升后下降的趋势,该基因在胚胎期E7就有表达,E7以后表达量逐渐上升,在E18表达量达到高峰后下降.研究结果首次提供了鹅肌肉组织主要结构基因MYL1的全序列和蛋白特征信息,并揭示该基因在鹅肌肉组织发生和发育的功能.

藏猪MYL1基因的克隆及生物信息学分析

为了克隆藏猪肌球蛋白轻链1 (myosin light chain 1, MYL1)基因编码区序列,并对其进行生物信息学分析,试验根据NCBI网站GenBank中公布的野猪MYL1基因mRNA序列(登录号为NM;14374.2)设计特异性引物,以提取的藏猪背最长肌组织总RNA反转录得到的cDNA为模板,对藏猪MYL1基因编码区序列进行PCR扩增,将目的基因进行测序,应用生物信息学分析软件对藏猪MYL1基因编码区序列的同源性、蛋白质的结构和功能(氨基酸组成、一般理化性质、疏水性、二级结构及三级结构、磷酸化位点、跨膜螺旋结构和信号肽亚细胞定位及蛋白网络互作)进行分析。结果表明:藏猪MYL1基因编码区序列全长为453 bp;藏猪与野猪的亲缘关系最近,与斑马鱼的亲缘关系最远;藏猪MYL1基因编码区序列与野猪、牛、智人、马、绵羊、犬、穴兔、家鼠、鸡和斑马鱼的核苷酸序列相似性分别为100%、92.1%、91.4%、91.2%、91.2%、90.5%、90.3%、89.2%、80.6%和68.2%;藏猪MYL1蛋白存在19种氨基酸,由150个氨基酸组成;藏猪MYL1蛋白分子质量为16 657.86 u,分子式为C;H;N;O;S;,脂肪系数为79.33,理论等电点pI为4.63,不稳定系数为37.81,负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)总数为26个,正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)总数为15个,理论半衰期为30 h,为亲水蛋白;二级结构中α螺旋占比最大(58.67%),其次为无规则卷曲(24.67%),β转角(8.67%)和延伸链(8.00%)占比较小;三级结构与二级结构预测结果相符合;氨基酸序列中共有16个磷酸化位点,其中有8个丝氨酸磷酸化位点,6个苏氨酸磷酸化位点,2个酪氨酸磷酸化位点;无跨膜螺旋结构,为非跨膜蛋白;无信号肽,为非分泌蛋白;主要定位于细胞质(47.8%)中,在细胞核约占26.1%,在细胞骨架约占8.3%,在内质网、高尔基体、分泌系统的囊泡、液泡中均约占4.3%;与TNNC2蛋白及MYH1、MYH3、MYH7等蛋白之间存在互作网络关系,与TNNC2蛋白相关系数高达0.999,与肌球蛋白重链家族MYH1、MYH3和MYH7蛋白相关系数分别为0.979,0.975和0.971,与MYBPC1和TPM1蛋白相关系数均为0.969,与TPM2和TNNI3蛋白相关系数均为0.965。说明藏猪MYL1基因可能具有较强大的生物学功能。

猪MYL1和MYL2基因的mRNA在不同组织中的表达分析

为研究MYL1、MYL2基因在猪的不同组织中的mRNA的表达水平。本试验以大白猪为实验动物,首先,提取其心脏、肝脏、背最长肌、脂肪等组织的总RNA;其次,扩增MYL1、MYL2基因的cDNA序列;最后,以GAPDH基因作为内参,应用实时荧光定量PCR技术检测MYL1、MYL2基因在不同组织中mRNA的表达水平。结果表明:MYL1基因在背最长肌中表达量最高,MYL2基因在心肌和背最长肌表达量最高,在其它器官表达量很少甚至几乎不表达,说明MYL2基因可能对骨骼肌生长和发育起调节作用。本研究表明MYL1和MYL2基因的mRNA在同一猪种不同组织器官间表达量呈现显著性差异,可能与不同组织器官的功能相适应,可为进一步研究猪的肌肉生长发育机理提供理论基础。

藏猪和大约克猪MYL1基因多态性及差异表达分析

为研究猪不同品种的MYL1基因的多态性及mRNA表达差异。本试验以藏猪和大约克猪作为实验动物,采用一代测序技术对藏猪(59头)和大约克猪(58头)MYL1基因起始密码子上游3 kb区域进行多态性检测;利用实时荧光定量PCR技术检测MYL1基因在背最长肌、背脂、肝脏组织差异表达情况。结果表明:藏猪和大约克猪在起始密码子上游3 kb区域发现T-159A突变位点并呈极显著差异(P<0.01);MYL1基因在背最长肌表达量最高,其次是背脂,肝脏的最低,在背最长肌中藏猪MYL1基因表达量极显著高于大约克猪(P<0.01),在背脂和肝脏组织中,藏猪MYL1基因表达量显著高于大约克猪(P<0.05)。推测T-159A位点可能是参与肌肉生长发育的重要调控位点。本研究为下一步开展MYL1基因对猪生长性能及其肉品质的影响提供参考依据。