非肌型肌球蛋白轻链激酶的结构、功能及其生理与病理学意义

肌球蛋白轻链激酶(myosin light-chain kinase,MYLK)在哺乳动物中由MYLK基因编码,编码的产物主要包括长链非肌型肌球蛋白轻链激酶(non-muscle myosin light-chain kinase,nm MYLK,220 kDa),短链平滑肌型肌球蛋白轻链激酶(smooth muscle myosin light-chain kinase,sm MYLK,130 kDa)及端蛋白(telokin)(17 kDa)。其中nm MYLK的特殊N端结构域赋予其参与更多病理生理学过程的特性,包括炎症、细胞黏附、肿瘤细胞浸润、动脉粥样斑块形成等。本文综述nmMYLK的结构、功能研究进展,梳理nmMYLK与炎症、癌症及其他疾病间的关系。

大鼠脊髓损伤后肌球蛋白轻链激酶的表达及意义

目的研究肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在大鼠脊髓损伤后的表达变化及意义。方法成年雄性SD大鼠100只,按随机数字表分为对照组(n=50)和损伤组(n=50),通过改良Allen’s的方法构建动物模型,建模后于12 h、1 d、3 d、5 d、7 d 5个时间点分别随机选取10只大鼠,处死后取损伤区脊髓组织,伊文斯蓝检测血-脊髓屏障通透性,通过RT-PCR及Western blot法检测MLCK的m RNA与蛋白表达和磷酸化肌球蛋白轻链(P-MLC)的蛋白表达。结果损伤组血-脊髓屏障通透性较对照组显著增高(P<0.05)。损伤组各时间点MLCK的mRNA与蛋白表达以及P-MLC蛋白表达较对照组显著增高(P<0.05)。结论大鼠脊髓损伤后MLCK表达增加可能参与血-脊髓屏障功能损害的发生机制。

肌球蛋白轻链激酶在肠梗阻发生及肠黏膜屏障损伤中的作用

目的研究在肠梗阻的发生和由肠梗阻引起的肠黏膜屏障损伤中,肌球蛋白轻链激酶(MLCK)所起的作用。方法选取因肠梗阻进行手术的28例患者为观察组,另选取30例同期健康体检人群为对照组,采用酶联免疫的方法测定观察组手术前、手术后第3天以及对照组的外周血MLCK含量。采集患者肠梗阻部位肠组织及肠梗阻旁正常肠组织标本,分别行HE染色、TUNEL细胞凋亡检测、免疫组织化学检测、免疫蛋白印迹(Western blot)检测。结果肠梗阻患者手术前外周血中MLCK的含量高于手术后及正常对照组,差异有统计学意义(F=177.69,P<0.001);患者手术后外周血MLCK含量和正常对照组差异无统计学意义(t=0.80,P=0.423)。HE染色显示,肠道黏膜损伤分级Chiu评分为3级;Tunel细胞凋亡检测显示,肠梗阻部位组织的凋亡细胞(31.66±4.04)多于正常肠组织(1.33±1.53),差异有统计学意义(t=-12.16,P<0.05)。MLCK及pMLC在梗阻肠组织的黏膜层和肌层中表达量上升,肠组织ZO-1在梗阻部位表达降低。结论梗阻部位肠组织大量破坏,细胞凋亡增加。MLCK、pMLC表达增高,ZO-1表达降低,可能是造成肠梗阻发生以及肠道黏膜屏障破坏引起败血症的重要原因。检测外周血MLCK含量可能可以作为肠梗阻诊断以及判断肠黏膜屏障损伤的辅助检查。

平滑肌肌球蛋白轻链激酶对肌球蛋白非Ca^(2+)依赖性磷酸化(2)

为了初步揭示肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对肌球蛋白(myosin)非Ca2+依赖性磷酸化的特征 试验方法采用10%甘油聚丙烯酰胺凝胶电泳检测myosin的磷酸化,用孔雀绿法测定myosin Mg2+-ATP酶活性及选择Scoin Image扫描软件分析所获得的数据。提出在MLCK参与的myosin活性调节中,myosin以非磷酸化、非Ca2+依赖性(CIPM)及Ca2+依赖性磷酸化(CDPM) 种状态存在 研究发现非Ca2+依赖性磷酸化myosin有以下特征:(1)耗能(Mg2+-ATP酶活性)高于非磷酸化myosin但低于Ca2+依赖性磷酸化myosin;(2)花生四烯酸(AA)可选择性加强myosin非Ca2+依赖性磷酸化;(3)在本试验条件下,未观察到MLCK抑制剂ML-9对非Ca2+依赖性myosin磷酸化的抑制作用;(4)组胺(histamine)对非Ca2+依赖性的抑制小于对Ca2+依赖性磷酸化的抑制,且这些差异在统计学上有显著性。以上结果提示myosin非Ca2+依赖性磷酸化不仅在程度上。

白藜芦醇下调肌球蛋白轻链激酶过表达抑制大鼠肝肿瘤增生

目的研究白藜芦醇(Res)通过影响肌球蛋白轻链激酶(MLCK)在肝脏中表达水平抑制原发性肝癌的增生。方法采用口服饮水中含0.9 mmol.L-1二乙基亚硝胺10周诱发原发性肝肿瘤;20周后,治疗组大鼠每天给予肌肉注射Res 50 mg.kg-16周;26周后,处死大鼠,计数肝表面癌结节数,称量和计算体重、肝重,肝/体重比,测定血清中甲胎蛋白的变化,观察大鼠肝脏的病理改变;用免疫组化和Westernblot法检测Res对MLCK的表达影响,用细胞凋亡试剂盒检测Res诱导肿瘤细胞的凋亡。结果 Res治疗组大鼠和模型组大鼠相比,体重增加,肝肿瘤结节数和肝/体重比和血清甲胎蛋白值减少或降低(P<0.05)。模型组大鼠肝组织MLCK的表达水平明显增加,而Res治疗可逆转MLCK的过表达水平,并诱导肿瘤细胞凋亡。结论 Res通过下调肝组织MLCK的表达水平诱导凋亡,抑制大鼠肝肿瘤细胞的增生。

褪黑素对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶表达及活性的影响

目的探讨褪黑素(melatonin,MLT)对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶(MLCK)表达与活性的影响。方法复制动脉粥样硬化兔模型,采用免疫组化和Western blot分析主动脉MLCK蛋白表达,γ-32P-ATP参入法检测MLCK活性。结果成功建立动脉粥样硬化兔模型,高脂喂食12wk,兔主动脉MLCK蛋白表达水平增加,活性上升,经MLT治疗后动脉粥样硬化斑块减少,MLCK蛋白表达下降,活性下降。结论动脉粥样硬化的形成与MLCK蛋白表达与活性升高有关,MLT能降低动脉MLCK蛋白表达和活性。

电针对骶上脊髓损伤后逼尿肌亢进大鼠逼尿肌中环腺苷酸和蛋白激酶A含量及肌球蛋白轻链激酶磷酸化的影响

目的探讨电针改善骶上脊髓损伤休克期后逼尿肌反射亢进的可能机制。方法60只雌性Sprague-Dawley大鼠按随机数字表抽取12只作为空白组,12只作为假手术组,剩余36只采用改良T10脊髓横断法制作神经源性膀胱模型,从符合要求的模型大鼠中二次随机抽取12只作为模型组,12只作为电针组。造模术后第19天取次髎、中极、三阴交行电针干预,连续治疗7 d后行尿流动力学检测,ELISA法测定逼尿肌环腺苷酸(cAMP)、蛋白激酶A(PKA)含量、Western blotting法测定逼尿肌磷酸化肌球蛋白轻链激酶(p-MLCK)水平。结果与空白组和假手术组比较,模型组膀胱最大容量及膀胱顺应性明显降低(P<0.01),膀胱基础压和漏尿点压明显升高(P<0.01);逼尿肌cAMP和PKA含量明显降低(P<0.01),逼尿肌p-MLCK水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较,电针组膀胱最大容量及膀胱顺应性明显增加(P<0.01),膀胱基础压和漏尿点压降低(P<0.05);逼尿肌内cAMP和PKA含量升高(P<0.05),逼尿肌p-MLCK水平升高(P<0.05)。结论电针次髎、中极、三阴交穴可改善完全性脊髓损伤后逼尿肌亢进大鼠膀胱功能,其作用机制可能与电针上调逼尿肌中cAMP、PKA表达,使MLCK磷酸化而失活,从而促进逼尿肌舒张有关。

重组鼠源性肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达

目的:制备能在原核表达系统中表达并特异性识别(Asp)4-Lys序列的鼠源性肠激酶,为推广应用重组肠激酶提供技术平台。方法:采用RT-PCR从C57BL/6J小鼠的十二指肠肠系膜黏膜组织中钓取肠激酶轻链的cDNA,将其克隆入pET32a原核表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,然后以镍亲和层析法对表达产物进行纯化。结果:所钓取的肠激酶轻链编码序列与GenBank中的序列一致,比较发现其编码的氨基酸序列在小鼠与人、牛之间的同源性大于75%。利用pET32a/BL21(DE3)表达系统成功地在大肠杆菌中表达了重组鼠源性肠激酶轻链,表达量约占大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白的30%,但多以包涵体的形式存在。经镍亲和层析法纯化的重组肠激酶多以聚体形式存在。结论:鼠源性肠激酶轻链在原核细胞中多以包涵体形式表达,天然构象重组肠激酶的获得还需对表达系统进行优化。

牛肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

为克隆表达牛肠激酶(enterokinase)轻链(EKL)编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCmT载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果表明,克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致,得到了编码正确的牛肠激酶轻链基因全序列。随后,将目的基因片段插入pET39b中,构建了融合型表达载体pET39b EKL,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。所获得的pET39b EKL经过酶切鉴定和测序,证实其插入方向、读码框架正确,所表达重组蛋白经SDS PAGE分析,相对分子量为65kDa,表达量达28%,通过镍亲和层析纯化得到融合蛋白DsbA rEKL的单一条带。该粗酶经脱盐后在适宜的缓冲体系中21℃温育过夜,显示出较高的自催化切割活性,为进一步进行重组牛肠激酶活性的研究及应用奠定了基础。

Vit E对动脉粥样硬化模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶表达的影响

目的 研究动脉粥样硬化 (AS)模型兔动脉肌球蛋白轻链激酶表达的变化以及VitE对MLCK表达的影响。方法 复制AS兔模型 ;颈动脉取血后检测血清标本中各种血脂成分的变化 ,用免疫组化法和Westernblot分析动脉粥样硬化模型兔动脉MLCK的表达。结果 成功建立AS兔模型 ,模型血清中各种脂质发生显著变化。免疫组化和West ernblot实验表明 ,动脉粥样硬化模型兔在喂食胆固醇膳食 4wk和 12wk后动脉MLCK的表达增强 ,在喂食胆固醇膳食12wk同时添加VitE时 ,MLCK表达降低。结论 AS模型兔动脉MLCK的表达增强与动脉粥样硬化的形成相关。VitE可能是降低动脉MLCK表达的因素 ,同时抑制动脉粥样硬化的形成。

VitE对动脉粥样硬化模型兔肝脏肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

目的 探讨维生素E(VitE)对动脉粥样硬化模型兔肝脏MLCK活性及表达的影响。方法 复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 3 2 P参入法检测肝脏MLCK活性 ,免疫荧光法检测肝组织MLCK的表达。结果 动脉粥样硬化兔模型建立成功 ,在喂胆固醇 4wk及 12wk的动物组 ,肝脏MLCK活性[分别为 (1884 8 7± 74 34 3)、(18818 3± 346 9 9)cpm·mg-1protein]与正常对照比较 [(6 6 77 5± 10 9 6 0 )cpm·mg-1pro tein]升高 (P <0 0 5 ) ;但在喂胆固醇同时添加VitE后 ,肝脏MLCK活性 [(10 898 8± 2 0 4 1 2 )cpm·mg-1protein]与正常对照组比较升高不明显 (P >0 0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔肝在喂食胆固醇膳食 4wk后MLCK的表达有所增强 ,12wk后显著增强 ,12wk组的膳食中同时加VitE后 ,MLCK表达有所下降。结论 在动脉粥样硬化过程中 ,肝脏病变可能与MLCK活性增强有关 ,VitE可能是降低肝脏MLCK活性的因素 。

平滑肌肌球蛋白轻链激酶的非激酶作用及对ATP酶活性的调节

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶活性和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为探寻MLCK的非激酶活性区域对MLCK活性的影响,以进一步阐明MLCK的非激酶活性在调节平滑肌收缩过程中的分子机制.采用PCR技术构建MLCK部分氨基酸缺失的重组表达载体pGEX-F6·5/D,经大肠杆菌表达得到可溶性GST融合蛋白,利用SDS-PAGE及Western印迹鉴定表达的MLCK在细胞中的分布,结果还显示,提取液的上清和沉淀中均有MLCK片段的表达.运用亲和层析技术分离并纯化删除前、后表达的MLCK片段(F6·5和F6·5/D),经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B纯化,SDS-PAGE鉴定显示为单一表达条带.应用EnzChek磷分析试剂盒和孔雀绿两种方法分别测定不同浓度的MLCK对非磷酸化肌球蛋白Mg2+-ATP酶活性的影响.两种MLCK的片段均具有激活ATP酶活性的作用,并随MLCK浓度的增加,酶的活性增加.比较删除前后不同MLCK片段对ATP酶活性的影响结果显示,删除MLCK片段1002位丙氨酸至1019位亮氨酸后,对ATP酶的激活作用较删除前明显降低,表明删除的部分氨基酸序列为MLCK非激酶活性所必需的区域.利用电镜技术观察到MLCK片段(F6·5)使非磷酸化肌球蛋白构象发生明显的变化.加入MLCK片段后肌球蛋白的构象由非活性型转化为活性型,并且MLCK片段还具有促进肌球蛋白单体形成肌丝的作用.

肌球蛋白轻链激酶和Rho激酶在兔脑血管平滑肌细胞迁移中的作用

目的探讨肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和Rho激酶在颅内血管平滑肌细胞(VSMC)迁移中的作用。方法体外培养兔大脑中动脉VSMC。构建携带反义MLCK cDNA的腺病毒载体并转染VSMC以降低MLCK表达。应用Rho激酶特异性抑制剂Y-27632来抑制Rho激酶的活性。免疫印迹法测定细胞内MLCK和Rho激酶的表达水平;改良Boyden小室法检测血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)诱导的VSMC迁移;甘油凝胶电泳和免疫印迹法检测肌球蛋白轻链(MLC)的磷酸化水平。结果反义MLCK cDNA转染后,MLCK表达量较LacZ基因转染组下降(84.6±5.8)%(P<0.01),但ATⅡ刺激引起的MLC磷酸化和VSMC迁移未受明显影响(P均>0.05)。Y-27632预处理反义MLCK cDNA转染后的VSMC可明显降低基础水平以及ATⅡ刺激引起的MLC磷酸化,并部分阻断VSMC迁移(P均<0.05)。结论颅内、外动脉VSMC迁移的分子机制不同,在ATⅡ诱导的颅内VSMC迁移中MLCK作用有限,而Rho激酶可能通过非钙依赖型MLC磷酸化途径发挥重要作用。

内皮细胞肌球蛋白轻链激酶在肉瘤细胞向血管外游走过程中的调节作用

目的 :阐明肉瘤细胞向血管外游走的过程及游走过程中内皮细胞肌球蛋白轻链激酶的调节作用。方法 :利用体外肉瘤细胞向血管外游走模型 ,观察肉瘤细胞的血管外游走状况 ;并测定肉瘤细胞向血管外游走过程中血管内皮单细胞层的电阻变化。结果 :肉瘤细胞可以穿过血管内皮细胞间缝隙游走至血管外 ;肉瘤细胞向血管外的游走能够引起单层血管内皮细胞的电阻下降 ;而内皮细胞肌球蛋白轻链激酶抑制剂 (ML - 7)能够抑制肉瘤细胞向血管外的游走、并抑制游走过程中引起的血管内皮单细胞层电阻下降。结论 :内皮细胞肌球蛋白轻链激酶可以升高血管内皮细胞肌球蛋白轻链的磷酸化水平 。

脑缺血病人血小板肌球蛋白轻链激酶和Ca^(2+)、Mg^(2+)-ATP酶活性及其与[Ca^(2+)]i关系的研究

目的探讨急性缺血性脑血管病血小板肌球蛋白轻链激酶（ＭＬＣＫ）和Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性的变化及与血小板胞浆游离钙浓度［Ｃａ２＋］ｉ的关系。方法用３２Ｐ同位素掺入法和比色法分别测定５８例脑缺血病人，及３５名健康对照者血小板ＭＬＣＫ和Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性。用荧光钙指示剂Ｆｕｒａ－２负载血小板扫描的方法，测定脑缺血病人血小板［Ｃａ２＋］ｉ浓度。结果ＴＩＡ组和脑梗死组ＭＬＣＫ活性与对照组相比均有明显增加（Ｐ＜０．０１），而Ｃａ２＋Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性均低于对照组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）。ＴＩＡ组和脑梗死组血小板静息［Ｃａ２＋］ｉ；均高于对照组；血小板静息［Ｃａ２＋］ｉ与血小板ＭＬＣＫ活性呈显著正相关（Ｐ＜０．０１），而与血小板Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性呈负相关（Ｐ＜０．０５）。结论血小板ＭＬＣＫ和Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶活性与急性缺血性脑血管病的发生有密切关系，ＭＬＣＫ活性的变化可能是脑缺血病人血小板活化的分子基础。

高脂血症对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响

目的探讨高脂血症对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶活性及表达的影响。方法胆固醇喂食大鼠4周和12周,颈动脉取血后检测血清标本中血脂成分的变化,免疫组化和Westernblot分析动脉肌球蛋白轻链激酶的表达,γ32P参入法检测动脉肌球蛋白轻链激酶活性。结果血清中各种脂质发生显著变化,大鼠在喂食胆固醇膳食4周和12周后动脉肌球蛋白轻链激酶表达显著增强,肌球蛋白轻链激酶活性显著升高。结论胆固醇对大鼠动脉肌球蛋白轻链激酶的表达与活性变化相关,肌球蛋白轻链激酶表达与活性变化可能是高脂血症形成的因素。

维生素E对动脉粥样硬化兔动脉肌球蛋白轻链激酶活性及内膜通透性的影响

目的 :探讨维生素 E(Vit E)对动脉粥样硬化兔动脉肌球蛋白轻链激酶 (ML CK)活性及内膜通透性变化的影响。方法 :复制兔动脉粥样硬化模型 ,用γ 32 P掺入法检测动脉 ML CK活性 ,免疫荧光检测内膜通透性 ,同时用苏木精伊红 (HE)染色观察动脉壁的形态结构。结果 :在喂饲胆固醇膳食 4周的动物组 ,动脉 ML CK活性与正常对照组比较显著升高 (P<0 .0 5 ) ;但在喂饲胆固醇膳食 12周或同时添加 Vit E后 ,动脉 ML CK活性与正常对照组比较升高不明显 (P>0 .0 5 )。荧光显微镜下观察显示 ,兔动脉内膜通透性在喂饲胆固醇膳食后 4周有所增加 ,12周后显著增加 ;12周组膳食中同时加 Vit E后 ,通透性有所下降。结论 :在动脉粥样硬化早期 ,内膜屏障完整性的改变可能与 ML CK活性增强有关 ,Vit E可能是降低动脉内膜 ML CK活性的因素 ,并能降低动脉粥样硬化模型兔动脉内膜通透性。

肌球蛋白轻链激酶在急性肺损伤模型的表达及意义

目的通过建立细菌脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺损伤模型,并观察其炎症程度和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达,探讨MLCK在急性肺损伤发病机制中的作用。方法20只BALB/c雌性小鼠,按随机数字表法分为LPS组(n=10)和生理盐水对照组(n=10),LPS组鼻内注入30μL含20μg LPS的生理盐水,对照组仅用生理盐水。比较两组的病理学、湿干比重、肺泡灌洗液(BALF)总细胞计数的不同,并采用免疫组化法观察MLCK在肺组织的表达,用RT-PCR法检测肺组织中MLCK mRNA的表达。结果与对照组比较,LPS组表现为明显的肺充血、水肿、中性粒细胞浸润,肺含水量增加,BALF细胞总数含量增高(P<0.05或P<0.01);免疫组化结果显示,LPS组MLCK表达较对照组更明显;RT-PCR结果显示LPS组MLCK mRNA吸光度值较对照组高。结论LPS能导致急性肺损伤,MLCK活性上调在其发病机制中起一定作用。

肌球蛋白轻链激酶非激酶活性调节磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动

肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)具有激酶和非激酶活性,在平滑肌收缩过程中起着关键酶调控的作用.为进一步阐明MLCK非激酶活性在平滑肌收缩过程中的调节作用,利用已删除部分激酶区域的MLCK重组体(pGEX-F6.5)在大肠杆菌中进行表达,采用亲和层析技术纯化表达的MLCK片段,应用EnzChek磷分析试剂盒检测MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、水解重酶解肌球蛋白(heavy meromyosin,HMM)及肌球蛋白亚片段1(subfragment1,S1)ATP酶活性的影响,体外检测MLCK片段对肌动蛋白肌丝运动的调节.研究结果显示,pGEX-F6.5重组表达载体在大肠杆菌中以可溶性GST融合蛋白的形式表达.该融合蛋白经Glutathione-Sepharose4B纯化、SDS-PAGE鉴定得到较纯的单一表达条带.纯化的MLCK片段对磷酸化肌球蛋白、HMM和S1的ATP酶活性均有明显激活作用.MLCK片段激活磷酸化肌球蛋白ATP酶活性为:Vmax=(19.426±1.669)倍;Km=(0.486±0.106)μmol/L,MLCK片段对磷酸化HMM和S1的ATP酶活性也有相似的刺激作用.体外肌丝运动研究表明,随着MLCK片段浓度的增加,磷酸化肌球蛋白与肌动蛋白结合的数量不断增加,肌丝运动的速度也随之增加.上述结果表明,MLCK的C端非激酶活性具有调节磷酸化的肌球蛋白ATP酶活性及肌丝运动的作用.