平滑肌肌球蛋白轻链激酶对肌球蛋白非Ca^(2+)依赖性磷酸化(2)

为了初步揭示肌球蛋白轻链激酶(MLCK)对肌球蛋白(myosin)非Ca2+依赖性磷酸化的特征 试验方法采用10%甘油聚丙烯酰胺凝胶电泳检测myosin的磷酸化,用孔雀绿法测定myosin Mg2+-ATP酶活性及选择Scoin Image扫描软件分析所获得的数据。提出在MLCK参与的myosin活性调节中,myosin以非磷酸化、非Ca2+依赖性(CIPM)及Ca2+依赖性磷酸化(CDPM) 种状态存在 研究发现非Ca2+依赖性磷酸化myosin有以下特征:(1)耗能(Mg2+-ATP酶活性)高于非磷酸化myosin但低于Ca2+依赖性磷酸化myosin;(2)花生四烯酸(AA)可选择性加强myosin非Ca2+依赖性磷酸化;(3)在本试验条件下,未观察到MLCK抑制剂ML-9对非Ca2+依赖性myosin磷酸化的抑制作用;(4)组胺(histamine)对非Ca2+依赖性的抑制小于对Ca2+依赖性磷酸化的抑制,且这些差异在统计学上有显著性。以上结果提示myosin非Ca2+依赖性磷酸化不仅在程度上。

蛋白磷酸酶1与Ca^(2+)/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ在心肌病中研究进展

蛋白质的磷酸化与去磷酸化是细胞信号转导过程中最重要的调控方式,其循环过程就像调控分子的开关一样,参与众多生理活动。负责这一修饰调节的是蛋白激酶与蛋白磷酸酶。报道显示人类染色体编码多达500个蛋白激酶,这些蛋白激酶满足人类高度多样性与差异性调控蛋白磷酸化作用,而有趣的是人类编码的蛋白磷酸酶却仅仅约为150个,其中约有40个是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。越来越多的证据表明蛋白磷酸酶/蛋白激酶调控异常在心肌病中起关键作用。蛋白磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)是一多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,研究显示PP1在心肌肥厚和心衰的发生发展过程中起重要作用。而Ca2+/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它作为Ca2+信号转导的关键因子,调节细胞的多种生物学功能,其功能异常可引起肥厚心肌胞内钙稳态失衡进而引起心律失常等心肌病。该文就PP1与CaMKⅡ的功能和心肌病的关系作一综述。

肾上腺素诱导分化的PC12细胞中微管相关蛋白-2C磷酸化的机制研究

肾中上腺素受体介导内源性儿茶酚氨的作用并显示可以影响神经原的发育。微管相关蛋白-2是一种重要的细胞骨架蛋白，其磷酸化参与调节神经突起的生长和神经原的可塑性。本研究拟观察肾上腺素对分化的PC12细胞中MAP-2的磷酸化的影响并分析其可能的作用机理。实验中我们发现肾上腺素可以时间及剂量依赖性地促进分化的PC12细胞中MAP-2C丝氨酸136位的磷酸化水平。

平滑肌收缩的非钙依赖性调节机制

在平滑肌收缩活动中 ,肌球蛋白轻链激酶 (MLCK)对肌球蛋白轻链 (MLC2 0 )的钙依赖性磷酸化是引起平滑肌收缩的主要原因 ,同时还存在着其它非钙依赖性的调节途径。高浓度的MLCK和Ca2 + independentLC2 0kinase均可引起MLC2 0 的非钙依赖性磷酸化 ;Rho kinase、花生四烯酸及蛋白激酶C等都能抑制肌球蛋白轻链磷酸酶的活性 ,减少MLC2 0 的脱磷酸化 ;调宁蛋白、原肌球蛋白和钙介导蛋白等能通过与肌动蛋白或肌球蛋白的结合来调节肌球蛋白Mg2 + ATP酶活性。这些因素都有助于维持低Ca2 + 时平滑肌的张力。

细胞蛋白依赖性激酶10与病理性瘢痕

1970年，PaulNurse等以裂殖酵母为实验材料，发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2等。CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin—dependent kinase，CDK），因此CDC2又被称为CDKl，激活的CDKl可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应。

锂对慢性铝暴露大鼠脑内CDK5和PP2A表达的影响

目的研究锂对慢性铝暴露大鼠脑内周期蛋白依赖性激酶5(CDK5)和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)表达的影响,进一步探讨锂抑制tau蛋白磷酸化的作用机制。方法慢性铝暴露大鼠12只,随机分为锂治疗组和非治疗组。锂治疗组给予氯化锂[200mg/(kg·d)]溶液连续灌胃6周;非治疗组以等量生理盐水灌胃。另取6只同月龄非铝暴露大鼠为正常对照组。Morris水迷宫测试3组大鼠学习记忆功能;Western blotting检测大鼠大脑皮层及海马磷酸化tau蛋白、CDK5、PP2A的表达。结果慢性铝暴露非治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量、CDK5表达明显高于正常对照组大鼠(P<0.05),且慢性铝暴露非治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量与CDK5表达呈正相关(r=0.702,P=0.036)。锂治疗组大鼠脑内磷酸化tau蛋白含量、CDK5表达明显低于非治疗组(P<0.05),且锂治疗组大鼠脑内CDK5表达与磷酸化tau蛋白含量呈正相关(r=0.871,P=0.024),而正常组、锂治疗组和非治疗组大鼠皮层及海马PP2A含量无明显差异(P>0.05)。结论抑制脑内CDK5表达可能是锂降低tau蛋白过度磷酸化,减少大鼠脑内神经原纤维缠结的又一途径。

CyPA及p-ERK1/2在动脉粥样硬化大鼠血管内皮中的表达

目的观察动脉粥样硬化(AS)大鼠血管内皮功能以及亲环素A(Cy PA)和磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(pERK1/2)的表达变化。方法将30只雄性Wistar大鼠随机分为3组(每组10只):对照组、AS 12周组,AS 16周组。对照组给予基础饲料喂养+腹腔注射等量生理盐水;AS组给予高脂饲料喂养+维生素D3注射液60万IU/kg一次性腹腔注射。对应不同造模时间处死大鼠,分离腹主动脉,观测离体腹主动脉环对乙酰胆碱的舒张反应;HE染色、免疫组化法检测动脉血管壁Cy PA及p-ERK1/2的表达。结果与对照组比较,AS 12周、AS 16周组血管内皮功能下降,3组差异有统计学意义(P<0.05);HE染色显示对照组大鼠血管壁呈正常结构,AS 12周组大鼠内皮细胞破坏、平滑肌细胞增生,AS 16周组粥样钙化斑块形成;免疫组化分析显示3组大鼠血管壁内Cy PA及p-ERK1/2表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论随着AS程度加重,大鼠血管内皮依赖性舒张功能明显下降,动脉粥样钙化斑块严重,Cy PA及p-ERK1/2表达显著增加。Cy PA、p-ERK1/2信号机制参与加重血管动脉粥样硬化进展,可能是促进AS进展的途径之一。

ERK在NGF诱导PC12细胞分化中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK)在NGF诱导的PC12细胞分化中的作用机制。方法以NGF处理PC12细胞建立分化模型,运用免疫印迹检测不同浓度不同作用时间时NGF对ERK1/2蛋白和磷酸化ERK1/2蛋白水平的影响,并观察MAPK/ERK激酶(MEK)抑制剂U0126对NGF诱导的细胞形态学改变的影响。结果ERK1/2蛋白的磷酸化呈现NGF剂量和时间依赖性。NGF作用细胞5min即可观察到明显的ERK1/2蛋白磷酸化,持续1h左右,2h时降低到初始水平,而细胞形态的改变出现在NGF作用12h以后。倒置相差显微镜观察可见PC12细胞分化的程度与ERK1/2活化持续的时间正相关,U0126可完全即时抑制ERK1/2的活化,而ERK1/2活化的抑制可完全阻断NGF诱导的PC12细胞分化。结论ERK1/2的活化是PC12细胞发生分化的必需事件,其活化时间的长短对分化具有决定作用。

双歧杆菌对腹腔巨噬细胞ERK1/2蛋白激酶通道的影响

目的 探讨双歧杆菌对巨噬细胞ERK1/ 2蛋白激酶通道的调控。方法 收集SD大鼠腹腔巨噬细胞,提取细胞浆蛋白及核蛋白,采用Western印迹分析双歧杆菌对巨噬细胞ERK蛋白激酶水平的影响。结果 双歧杆菌呈浓度依赖性诱导巨噬细胞ERK1/ 2的活化。10 3/ ml的双歧杆菌即可增加ERK1/ 2磷酸化。用10 5/ ml的双歧杆菌刺激巨噬细胞,ERK1/ 2磷酸化30 min达到高峰。特异性ERK蛋白激酶抑制剂PD980 5 9能显著降低双歧杆菌诱导的巨噬细胞ERK1/ 2的活化。结论 双歧杆菌可以通过ERK蛋白激酶通道调控巨噬细胞。

CDK2与孕激素受体转录激活的研究进展

孕激素受体（progesterone receptor,PR）介导孕激素对乳腺及女性生殖系统生长、发育的调控,其机制为通过对靶基因的转录调控实现。PR转录后修饰对靶基因的转录起着关键调控作用,包括乙酰化、泛素化、磷酸化等,以磷酸化修饰最为常见。

莪术油注射液对慢性低氧大鼠学习与记忆的影响

本文旨在探讨莪术油注射液对慢性低氧大鼠学习与记忆的影响及其可能机制。将Sprague-Dawley大鼠随机分为对照组、慢性低氧组、5mg/kg体重莪术油组、10mg/kg体重莪术油组、20mg/kg体重莪术油组,每组14只。慢性低氧处理采用低氧舱内吸入大约10%O2、5%CO2,饲养10h/d,持续饲养28d。莪术油组大鼠低氧处理前腹腔注射相应浓度的莪术油注射液。实验结束次日,通过Morris水迷宫测试各组动物学习和记忆成绩的变化;测定各组大鼠血清和海马组织丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及海马组织Ca2+浓度([Ca2+i]);通过免疫组织化学和Western blot检测磷酸化Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(phosphorylated Ca2+/calmodulin-dependent pro-tein kinase II,p-CaMKII)在海马组织和胞膜上的表达。结果显示,与对照组相比,慢性低氧组大鼠隐蔽平台的逃避潜伏期明显延长(P<0.05),血清和海马组织MDA含量明显增高,SOD活性显著降低(P<0.05,P<0.01),海马组织[Ca2+]i明显增高(P<0.01),海马p-CaMKII表达量显著降低(P<0.01)。与慢性低氧组比较,莪术油各组发生以下变化:10、20mg/kg体重莪术油组大鼠隐蔽平台的逃避潜伏期显著缩短(P<0.05);5、10、20mg/kg体重莪术油组大鼠血清和海马组织MDA含量均显著降低(P<0.05,P<0.01);10、20mg/kg体重莪术油组大鼠血清SOD活性显著增加(P<0.01);5、10、20mg/kg体重莪术油组大鼠海马组织[Ca2+]i明显降低(P<0.01);10、20mg/kg体重莪术油组大鼠海马p-CaMKII表达也明显增加(P<0.05,P<0.01)。以上结果提示,莪术油改善慢性低氧导致的大鼠学习与记忆能力下降,其机制可能与降低血清和海马组织MDA含量、增加SOD活性、降低海马组织[Ca2+]i和/或增加海马组织p-CaMKII表达有关。

低氧预适应保护缺血脑组织效应中CaMKⅡ的作用机制

目的探讨钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在低氧预适应(HPC)保护小鼠缺血脑组织中的作用。方法36只健康雄性BALB/c小鼠随机分为常氧假手术组、HPC假手术组、常氧缺血组和HPC缺血组,每组6只应用Western blot并结合Gel Doc凝胶成像系统定量检测4组小鼠脑组织内CaMKⅡ蛋白表达量和磷酸化水平的变化,用免疫组化检测常氧缺血组和HPC缺血组小鼠脑皮层CaMKⅡ磷酸化水平。结果与常氧假手术组相比,常氧缺血组小鼠皮层缺血核心区和半影区CaMKⅡ蛋白表达量和磷酸化水平均显著降低(P<0.05),HPC缺血组缺血半影区CaMKⅡ磷酸化水平及p-CaMKⅡ阳性细胞数目高于常氧缺血组(P<0.05)。结论HPC减缓缺血半影区CaMKⅡ磷酸化水平的降低,可能参与减轻因中脑动脉闭塞所致小鼠缺血性脑损伤作用。

miR-130b对宫颈癌细胞修复TNF-α诱导性基因组双链DNA断裂作用的影响及机制

目的观察miR-130b对宫颈癌细胞修复基因组双链DNA断裂作用的影响,并探讨其机制。方法将宫颈癌细胞Siha分成6组,分别转染细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制物1A(CDKN1A)基因过表达质粒pc DNA3. 1-CDKN1A(CDKN1A组)、pc DNA3. 1空载质粒(pc DNA3. 1组)、miR-130b mimics (miR-130b组)、miR-130b阴性对照核酸(NC组),共转染pc DNA3. 1-CDKN1A和miR-130b mimics (CDKN1A+miR-130b组)、pc DNA3. 1和miR-130b mimics (pc DNA3. 1+miR-130b组)。TNF-α刺激细胞,用彗星试验测定基因组DNA尾距,流式细胞术测定磷酸化组蛋白2A变异体(γ-H2AX)蛋白; Real-time PCR、Western blotting法检测CDKN1A mRNA及其蛋白。分别将pc DNA3. 1/EGFP、pc DNA3. 1/EGFP-CDKN1A-wtUTR(野生型)、pc DNA3. 1/EGFP-CDKN1A-mutUTR(突变型)与miR-130b mimics或NC共转染Siha细胞,测定报告基因荧光相对活性;以TNF-α和DNA损伤增强剂AZD2461刺激各组细胞,用流式细胞术测定细胞凋亡水平。结果与pc DNA3. 1组比较,CDKN1A组细胞DNA尾距、γ-H2AX蛋白表达水平降低(P均<0. 05);与NC组比较,miR-130b组细胞DNA尾距、γ-H2AX蛋白表达水平、细胞凋亡率升高,CDKN1A mRNA、蛋白表达水平下降(P均<0. 05);与pc DNA3. 1+miR-130b组比较,CDKN1A+miR-130b组细胞DNA尾距、γ-H2AX蛋白表达水平、细胞凋亡率下降(P均<0. 05);与共转染NC细胞相比,共转染miR-130b mimics使野生型细胞荧光相对活性降低(P <0. 05),而未改变突变型细胞荧光相对活性。结论 miR-130b通过直接靶定CDKN1A mRNA抑制其表达干扰宫颈癌细胞修复双链DNA断裂位点,从而促进细胞凋亡。

黑逍遥散对APP/PS1双转基因小鼠海马和脑皮层CaMKⅡα蛋白及其磷酸化表达的影响

目的:观察黑逍遥散对阿尔茨海默症(AD)小鼠海马和脑皮层钙调蛋白依赖性激酶2α(CaMKⅡα)及其磷酸化表达水平的干预效应。方法:30只APP/PS1双转基因雄性小鼠称体质量并按随机原则分为模型组、盐酸多奈哌齐组、黑逍遥散组,每组10只。同月龄、同种系的野生型C57BL/6雄性小鼠10只为空白组。盐酸多奈哌齐组(6 g·kg-1)、黑逍遥散组(3. 25 mg·kg-1)分别连续给药90 d后,Morris水迷宫检测行为学变化,免疫组化和蛋白免疫印迹法检测小鼠海马区和脑皮层CaMKⅡα蛋白及其磷酸化的表达。结果:干预90 d后,与空白组比较,AD模型组小鼠,逃避潜伏期显著延长,跨原平台和有效区域次数显著减少(P <0. 01),小鼠海马区及脑皮层Ca MKⅡα蛋白表达显著减弱或降低,而p-CaMKⅡα蛋白表达显著升高(P <0. 05,P <0. 01);与模型组比较,盐酸多奈哌齐和黑逍遥散组小鼠的逃避潜伏期均显著缩短、跨原平台次数均显著增加(P <0. 01),小鼠海马区及脑皮层Ca MKⅡα蛋白显著增强或升高,p-CaMKⅡα蛋白表达显著降低(P <0. 05,P <0. 01)。结论:黑逍遥散通过调节AD小鼠不同脑区参与细胞记忆形成机制的关键蛋白Ca MKⅡα及其磷酸化表达,进而发挥改善AD小鼠的学习记忆能力。

右美托咪定对七氟醚麻醉的大鼠下丘脑内pCaMKⅡɑ表达的影响

目的:研究右美托咪定对使用七氟醚进行麻醉的大鼠下丘脑内磷酸化Ca^(2+)/CaM-依赖性蛋白激酶Ⅱα(pCaMKⅡα)表达的影响。方法:选择经侧脑室置管的大鼠20只作为研究对象。随机将其分为对照(control,Con)组和右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)组。经Con组大鼠的侧脑室小管注入无菌生理盐水0.1 mL,经Dex组大鼠的侧脑室小管注入浓度为20μg/mL的右美托咪定0.1 mL。注药30 min后用七氟醚对两组大鼠进行麻醉,在麻醉30 min时取其下丘脑组织,检测其中pCaMKⅡɑ的表达量,并在同一时间点取其脑电波频谱进行分析。结果:与Con组大鼠相比,Dex组大鼠的抑制性脑电波增多(P<0.05),兴奋性脑电波减少(P<0.05)。用七氟烷麻醉30 min时,与Con组大鼠相比,A组(给予右美托咪定30 min时)大鼠下丘脑内pCaMKⅡɑ蛋白的表达量更低(P<0.05)。与Con组大鼠、A组大鼠相比,B组(给予右美托咪定后用七氟醚麻醉30 min时)大鼠下丘脑内pCaMKⅡɑ蛋白的表达量更低(P<0.05)。结论:右美托咪定可对使用七氟醚进行麻醉大鼠的脑电波产生抑制,还可抑制麻醉过程中其下丘脑内pCaMKⅡɑ的表达。

体外Fas介导肿瘤细胞凋亡过程中cyclins/CDKs的变化规律及调节机制

目的:探讨Fas介导的细胞周期特异性细胞凋亡发生过程中,细胞周期蛋白(cyclins)和细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)的变化规律,及其可能的调节机制。方法:以急性淋巴细胞白血病Molt-4细胞株为靶细胞,建立Fas介导的细胞周期特异性凋亡模型;采用cyclin/DNA双参数流式细胞术和Western印迹法检测cyclins的表达规律;应用Western印迹法检测CDK1的Thr-161、Tyr-15位点和CDK2的Thr-160位点磷酸化水平的变化。结果:重组人Fas配体(re-combinant human Fas ligand,rhFasL)诱导Molt-4细胞的凋亡定位在G1期。在发生细胞凋亡效应前,cyclin D3水平明显升高,而cyclin E水平和CDK2的Thr-160位点磷酸化水平均明显下降;发生凋亡效应后,cyclin D3水平明显下降,而cyclin E水平升高,CDK2的Thr-160位点磷酸化水平则明显下降,CDK1的Thr-161、Tyr-15位点磷酸化水平稍有下降。Cyclin A和Cyclin B1水平在诱导细胞凋亡过程中无明显变化。Roscovitine在特定浓度(5μmol/L)下可下调CDK2 Thr-160位点和CDK1 Thr-161位点的磷酸化水平,与rhFasL共同作用后细胞凋亡的发生率明显升高。结论:Fas介导的细胞凋亡具有细胞周期特异性,并始动于晚G1期,是G1期cyclin E/CDK2活性下降以及晚G1期检测点监督的结果;cyclin D3/CDK复合体可能是决定细胞凋亡能否发生的关键。

SMYD3调控人乳腺癌MCF-7细胞增殖机制的研究

目的:通过转染技术抑制或增强SMYD3基因的表达,以探讨SMYD3对乳腺癌MCF-7细胞增殖的调控机制机制。方法:以MTT法和软琼脂克隆形成实验研究抑制或增强SMYD3基因表达对细胞增殖的影响,以RT-PCR法和Western印迹法检测MCF-7细胞经转染后,胞内SMYD3、ERK/MAPK通路相关蛋白及其磷酸化产物,以及凋亡和细胞周期调控相关蛋白表达水平的变化。结果:用针对SMYD3基因的shRNAs表达质粒转染MCF-7细胞后,其SMYD3基因mRNA和蛋白表达水平下调,细胞生长受到抑制,细胞中ERK1/2、CyclinD1和CDK4蛋白水平明显下调;软琼脂克隆形成实验显示,增强SMYD3基因表达能明显促进MCF-7细胞克隆形成。结论:SMYD3可通过激活ERK/MAPK信号转导通路和上调细胞周期相关蛋白CyclinD1和CDK4的水平提高肿瘤细胞的增殖能力。