和田羊Myostatin蛋白成熟肽的基因克隆及原核表达

为了克隆和田羊肌肉生长抑制素(Myostatin)蛋白成熟肽编码基因片段,并对其进行原核表达,试验根据绵羊Myostatin蛋白成熟肽基因序列从GenBank(登录号为NM_001009428)中设计并合成1对引物。以塔里木大学动物基因工程实验室构建的和田羊Myostatin基因全序列的克隆载体为模板,采用PCR方法特异性扩增和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段;将其克隆到pMD18-T载体中,构建克隆质粒pMD18-T-Ms;经PCR和双酶切分析鉴定,将阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证;测序验证后双酶切pMD18-T-Ms克隆质粒和pET-28a(+)表达质粒,进一步构建pET-28a(+)-Ms重组表达质粒。将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达Myostatin蛋白成熟肽,通过SDS-PAGE电泳分析鉴定表达的重组蛋白。结果表明:PCR特异性扩增出1条长度约为330 bp的条带;序列测定分析显示和田羊Myostatin蛋白成熟肽基因片段长327 bp,与GenBank上绵羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因从799～1 125 bp片段的核苷酸同源性为100%,所表达的Myostatin蛋白成熟肽分子质量约为14.7 ku。试验成功克隆和田羊Myostatin蛋白成熟肽编码基因片段,构建了其克隆质粒pMD18-T-Ms和重组表达质粒pET-28a(+)-Ms,并在大肠杆菌中获得有效表达。

大鼠Myostatin蛋白成熟肽的原核表达及纯化

目的:利用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白表达系统在大肠杆菌中表达纯化Myostatin成熟肽。方法:应用RT-PCR从大鼠的腓肠肌mRNA中逆转录扩增Myostatin成熟肽编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T1中,IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用Western-blot用抗-GST抗体验证融合蛋白表达。融合蛋白经Glutathione-agarose色谱纯化。结果:PCR扩增的Myostatin基因序列与GenBank数据库中的序列一致;30°C,0.1mmol/LIPTG诱导16小时,GST-Myostatin融合蛋白获得优化表达,表达效率为25%;Western-blot证实融合蛋白的特异性表达。结论:成功构建融合蛋白GST-Myostatin重组基因,并在大肠杆菌中获得有效表达,为Myostatin抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定基础。

不同剂量红光和乙烯利处理对采后芒果成熟及活性氧代谢的影响

为了探明不同剂量红光照射及乙烯利处理对采后芒果成熟及活性氧代谢的影响,明确其在催熟中的使用剂量,以未进行任何催熟处理的芒果为对照(CK),分别采用300 lx(RL-300)和600 lx(RL-600)的红光以及400 mg/L(ETH-400)和1200 mg/L(ETH-1200)乙烯利对‘台农1号’芒果进行催熟处理,测定果实呼吸强度、乙烯释放量、活性氧含量及其酶促和非酶促清除能力相关指标,分析不同处理对芒果成熟和活性氧代谢的影响,筛选适宜的催熟方式。结果表明:RL-600和ETH-400处理对芒果的催熟效果较好,与CK相比,果实提前4 d成熟,呼吸强度峰值分别提高了18%和12%,乙烯释放量峰值分别提高了7%和17%,过氧化氢含量峰值分别提高了14.0%和9.6%,促进了抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶的活性与谷胱甘肽含量的上升,保持了活性氧(ROS)产生与清除系统的平衡;ETH-1200处理加速了芒果活性氧的累积,由于其抗坏血酸过氧化物酶及过氧化氢酶活性水平不足以清除过氧化氢导致芒果贮藏6 d时便发生过熟腐烂现象;RL-300处理组芒果的ROS相关酶活性较低,故活性氧过氧化氢的产生与清除水平均较低,从而无法促使芒果成熟。综上,RL-600和ETH-400处理可有效促进芒果成熟,其ROS的产生与清除系统能够维持平衡。

家鸡Leptin成熟肽cDNA的克隆、重组蛋白表达及纯化

从 18周龄鸡卵巢组织中抽提总 RNA,使用六聚体随机引物反转录后 ,用鸡 L eptin(瘦素 )特异性引物扩增出鸡L eptin编码区第 5 2～ 4 6 0 bp的长度为 4 0 9bp的 c DNA片段。根据鸡 L eptin的 3′端第 4 6 0～ 4 92 bp序列设计了 3条部分相互重叠并且顺序串联延伸的下游反义引物 ,并在最后 1条引物 3′端连接上 Eco R 切点 ;在以上用于反转录扩增的 5′端引物的 5′端连接一 Bam H 切点。用该 5′端引物分别与 3个 3′端引物配对 ,利用反转录扩增出的 4 0 9bp的L eptin c DNA片段作为第 1模板进行扩增 ,扩增产物再作为模板与下一引物对再次扩增。经 3次扩增得到编码鸡 L ep-tin成熟肽的全长 4 5 1bp的 c DNA序列。将该 4 5 1bp的 L eptin c DNA序列经 Bam H 和 Eco R 双酶切后 ,克隆入表达质粒 p RSET A的 Bam H 和 Eco R 两酶切位点之间 ,构建成表达质粒 p L ep- SCAU。转化有重组表达质粒 p L ep-SCAU的大肠杆菌 BL 2 1(DE3)在 L B培养基中培养后 ,经 IPTG诱导表达出相对分子质量为 2 0 10 0的鸡 L eptin融合蛋白和少量 4 0 2 0 0的 L eptin融合蛋白。L eptin融合蛋白的表达在 IPTG浓度为 0 .0 5 mmol/ L 时达到最高 ,占总菌体蛋白的 32 .6 %。用 Ni- NTA凝胶从 7L 发酵培养菌裂解液中纯化出 180 m

兔抗人BMP-2成熟肽抗血清的制备

目的利用在大肠杆菌中表达的人骨形成蛋白-2(hBMP-2)成熟肽,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清。方法将含有hBMP-2成熟肽基因的表达载体pDH2m,转化大肠杆菌,热诱导表达hBMP-2成熟肽,经纯化、复性后,再用其免疫兔子,制备兔抗hBMP-2成熟肽抗血清。并以Western-blot和免疫组化方法对抗血清进行鉴定。结果Western-blot结果显示在对应于hBMP-2成熟肽位置有阳性条带,免疫组化结果显示人软骨细胞胞浆阳性着色。结论hBMP-2成熟肽在大肠杆菌中获得高表达,并成功制备了兔抗hBMP-2成熟肽抗血清。

人源Nodal成熟肽的原核表达及多克隆抗体的制备

目的:表达人Nodal成熟肽,免疫小鼠制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达质粒pReceiver-hNodal,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达His6-hNodal融合蛋白,融合蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化后,回收融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。通过间接ELISA、Westernblot和免疫细胞化学染色和间接免疫荧光等方法检测抗体的效价和特异性。结果:在大肠杆菌中高效表达了与预期理论值大小相符的Mr约13 000的人Nodal成熟肽的融合蛋白,通过免疫小鼠制备的多克隆抗体效价高、特异性强。结论:成功制备了抗人Nodal成熟肽多克隆抗体,为进一步深入研究Nodal在肿瘤发生发展过程中的生物学功能奠定了基础。

抵抗素成熟肽的制备及其对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响

为探讨抵抗素成熟肽对猪葡萄糖和脂肪代谢的影响,将猪抵抗素成熟肽(MR)编码序列克隆至pET-32a(+),在大肠埃希菌中表达重组MR融合蛋白,并用Ni-NTA亲和层析纯化。经肠激酶消化切除融合蛋白,用Ni-NTA分离MR。随后将18头5月龄去势巴马香猪随机分为3个组,对照组肌肉注射生理盐水0.5mL,试验1组和2组分别肌肉注射20ng/kg和40ng/kg的MR,于注射后0、1、2、3、4、5h分别采血,检测血清葡萄糖及脂肪代谢相关指标。结果表明,重组MR融合蛋白分子质量为29ku,切除融合蛋白的MR分子质量为12ku,纯化的MR浓度约3mg/L。给予外源性MR后,试验组猪血清葡萄糖显著高于对照组(P<0.05);脂蛋白酯酶活性亦有升高的趋势,但组间差异不显著(P>0.05);两个试验组猪血清甘油三酯含量均显著降低,试验2组显著低于试验1组和对照组(P<0.05);试验2组猪血清游离脂肪酸含量显著高于试验1组和对照组(P<0.05)。由此可见,抵抗素能抑制组织细胞的葡萄糖摄入,并通过提高脂蛋白酯酶活性促进甘油三酯分解,在调节机体能量代谢与能量平衡中发挥重要作用。

大熊猫及其近种活化素基因β_A亚基成熟肽序列的克隆分析及其在分类地位上的应用

借鉴互联网中已经克隆到的Activin基因 βA 亚基成熟肽序列 ,设计并合成 1对兼并引物 ,利用PCR技术从大熊猫、小熊猫、马来熊的基因组DNA中直接扩增目的基因片段 ,并分别克隆到大肠杆菌载体pBlueScript+ 当中 ,然后对培养产物进行序列测定。DNA序列分析表明 ,三种物种的Activin基因 βA 亚基成熟肽序列长度均为 35 9bp ,无内含子。基因片段编码一个含有 119个氨基酸残基的肽段。大熊猫、小熊猫、马来熊在该成熟肽核苷酸和氨基酸序列上表现出高度的同源性 ,其中核苷酸同源性为 93.9% ,氨基酸同源性高达 99%以上。此外 ,3种动物的核酸限制性酶切图谱也高度相似。与GenBank中收录的其他物种Activin基因 βA 亚基成熟肽序列相比较 ,显示此片段在处于不同进化程度的物种之间仍具有高度保守性。运用系统发育与进化树软件包PHILIP ,并结合克隆序列对大熊猫、小熊猫、马来熊进化与分类地位进行了探讨。采用不同的统计学分析方法 ,所得到的 3个物种系统发育进化树的拓扑结构完全一致。相比较而言 ,大熊猫与马来熊有着较近的亲缘关系 ,而小熊猫与上述两个物种的亲缘关系相对疏远。结果支持将大熊猫与马来熊归为熊科、而将小熊猫单列成科的学术观点。这是首次以生殖相关的核基因作为研究对象 。

注射用心肌肽预处理对大鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

目的:探讨注射用心肌肽预处理对幼鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用,阐明其相应的作用机制。方法:通过结扎SD幼鼠冠状动脉左前降支建立缺血再灌注损伤模型。SD大鼠随机分为假手术组、模型对照组及注射用心肌肽预处理组(CMP组)。检测血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白T(Tn-T)和心肌组织匀浆丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(SOD)、总一氧化氮合酶(TNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量,免疫组织化学法检测NOS2(iNOS)、NOS3(eNOS)含量及Caspase-3蛋白表达水平;光学显微镜观察心肌梗死范围,透射电镜检测心肌组织结构改变;TUNEL法观察心肌凋亡细胞。应用实时荧光定量PCR分析心肌组织iNOS、eNOS、Caspase-3mRNA表达。结果:CMP组大鼠LDH、CK-MB、Tn-T含量低于模型对照组(P<0.05或P<0.01),MDA、SOD、TNOS、iNOS含量以及Caspase-3、iNOS表达水平较假手术组增高,但低于模型对照组(P<0.05或P<0.01)。CMP组与模型对照组大鼠比较,坏死(AN)/缺血危险面积(AAR)下降52%(P<0.01),心肌梗死范围缩小。模型对照组大鼠心肌片状出血,炎性细胞浸润,心肌细胞严重变性坏死,心肌细胞凋亡显著;而CMP组心肌细胞变性坏死程度较轻,血管结构正常,心肌凋亡细胞水平介于假手术组和模型对照组之间。结论:注射用心肌肽预处理对大鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能与减少NO生成,抑制心肌细胞Caspase-3mRNA和蛋白表达,从而减少细胞凋亡有关。

家蚕神经肽基因的筛查及成熟肽的预测

神经肽(neuropeptide)是家蚕Bombyx mori体内重要的调控物质。为了充分理解神经肽对家蚕发育的调控,扩充家蚕神经肽的数量,本研究利用BLAST的tblastn程序结合OpenOffice软件的查找程序,基于其他昆虫和无脊椎动物神经肽的同源性和保守的结构特点,在家蚕基因、理论蛋白质数据库及NCBI中进行全面而系统的基因筛查;并利用各种在线工具对所筛查到基因和理论蛋白质的结构和成熟肽进行预测分析。结果共获得allatostatin-A(AST-A),allatostatin-B(AST-B),allatostatin-C(AST-C),allatropin(AT),ecdysis-triggering hormone(ETH),crustaceancardioactive peptide(CCAP)和FMRFamide等31个神经肽基因家族,包括37个神经肽基因亚家族,共计44个神经肽基因;预测出193个成熟的神经肽,其中73个根据家族同源性预测在C末端发生酰胺化,而6个被预测在N末端发生了环化,9个被预测酪氨酸发生了硫酸化。大部分成熟神经肽都具有明显的家族结构特征,但proctolin,CCAP及CAPA-PK成熟肽结构上与其他昆虫相比有所扩展。结果提示,家蚕神经和内分泌细胞产生了几乎在所有昆虫中具有的神经肽前体;进化过程中大部分成熟神经肽的氨基酸序列在种间产生了差异,但家族特征性基序高度保守。本研究为神经肽功能研究以及神经肽对家蚕发育尤其是蛹期发育调控的研究奠定了基础。

C型钠肽预处理对牛卵母细胞体外成熟的影响

旨在研究C型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)预处理对牛卵母细胞体外成熟(In vitro maturation,IVM)的影响。以常规的牛卵母细胞体外24h成熟培养为对照,研究了CNP预处理牛卵母细胞6h,再进行成熟培养28h后(CNP预处理组)的牛卵母细胞成熟情况。结果表明,CNP预处理组的牛卵母细胞成熟效果明显提高,其受精后的囊胚率和囊胚细胞数都明显高于对照组((51.55%±2.50%),(156.2±11.0)和(28.13%±3.80%),(116.3±19.0),P<0.05);卵母细胞中线粒体分布由未成熟时的周边分布变为成熟时的均匀分布;而CNP预处理6h的卵母细胞中线粒体多呈半周边分布,在随后的28h成熟培养中也变为均匀分布;CNP预处理组的成熟卵母细胞线粒体DNA的拷贝数为(510 078.4±28 906.0),明显高于对照组的((416 558.5±51 743.0),P<0.05)。综上表明:C型钠钛预处理可以有效改善牛卵母细胞的体外成熟质量。

解淀粉芽孢杆菌DC-4豆豉溶栓酶成熟肽编码序列的克隆及表达

利用PCR方法从解淀粉芽孢杆菌DC 4总DNA中扩增出豆豉溶栓酶 (DFE)成熟肽编码区片段 .测序结果表明 :DFE成熟肽编码区长 82 5bp,编码 2 75个氨基酸残基 ,分子量为 2 7.7× 10 3 ,推导的N’ -端氨基酸序列与豆豉溶栓酶N’ -端氨基酸测序结果完全一致 ,说明克隆到的基因确实是豆豉溶栓酶基因 .同源性分析表明 ,DFE成熟肽编码区的核苷酸和氨基酸序列与日本纳豆激酶的同源性分别为 80 .0 %和 86 .5 % ,这提示豆豉溶栓酶可能是一种新型的溶栓酶 .将表达质粒pET Nde转化E .coliBL2 1(DE3)中 ,IPTG可诱导表达大量的DFE融合蛋白 ,占菌体可溶性蛋白的 4 0 % ,主要以包涵体的形式存在 .图 3表 1参

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素(DuIFN-α)并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a+连接后转化到BL21(DE3)获得工程菌BL2l(DE3)/pET32a+-DuIFN-α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒(VSV)、鸭瘟强毒(DPV)活性进行研究。结果表明:BL2l(DE3)/pET32a+-DuIFN-α经0.4mmol/L IPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37 ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质(Ni-MIAC)进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12 800 U/mg;利用定量PCR检测到15 U/mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN-α的临床应用提供试验数据。

林麝、马麝及梅花鹿活化素基因β_A亚基成熟肽序列的克隆和分析

活化素 (Activin)对睾丸和卵巢产生多重调节作用 ,对动物的繁育非常关键。本文参考已克隆的其它物种的活化素基因 βA 亚基成熟肽序列 ,设计一对简并引物 ,通过PCR方法从林麝 (Moschusberezovskii)、马麝 (Moschuschrysogaster)和梅花鹿 (Cervusnippon)的基因组DNA中直接扩增目的基因片段。将目的片段分别克隆到pMD1 8 T载体中 ,并进行序列测定。DNA序列测定及分析表明 ,林麝、马麝和梅花鹿的活化素基因 βA 亚基成熟肽序列长 3 45bp ,三物种核苷酸序列同源性在 98%以上 ,氨基酸序列同源性在99%以上 ,核酸限制性酶切图谱也高度相似。将它们与GenBank中已公布的其它物种的活化素序列进行比较 ,发现该片段在不同进化程度的物种间高度保守。这是首次从麝科动物中成功克隆与生殖相关的核基因 。

人骨保护素成熟肽表达载体的构建、表达及重组蛋白免疫学鉴定

目的 :构建人骨保护素 (OPG)成熟肽cDNA重组表达载体 ,实现其在毕赤酵母中的高效表达。方法 :由人成骨细胞提取总RNA ,经RT -PCR扩增得到人OPG成熟肽cDNA ,克隆入分泌型表达载体 pPIC9K ,转化酵母细胞 ,G418筛选多拷贝整合的重组子进行甲醇诱导表达 ,产物行Westernblotting 鉴定。结果 :成功构建了人OPG成熟肽表达载体 ,该载体能在酵母细胞中获得分泌表达 ,诱导96h的表达量占上清总蛋白的30 %。重组蛋白相对分子质量约55ku ,可被OPG抗体识别。结论 :重组人OPG成熟肽在酵母表达系统获得较高水平表达 ,为进一步研究开发基因工程药物准备了条件。

成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪中生物活性肽的影响

以不同条件成熟的牦牛乳硬质干酪为研究对象,探究成熟温度和时间对牦牛乳硬质干酪中水溶性多肽的DPPH自由基清除能力、抑菌性以及抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性的影响。结果表明,5℃、10℃、15℃成熟4~6个月牦牛乳硬质干酪的水溶性多肽对DPPH自由基均有清除能力。5℃、10℃成熟5个月、15℃成熟4个月牦牛乳硬质干酪的水溶性多肽对DPPH自由基清除率最高,分别为(20.38±1.20)%、(28.70±0.67)%和(30.19±0.32)%。5℃、10℃、15℃成熟的牦牛乳硬质干酪在4~6个月成熟过程中,其水溶性多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制程度分别呈增强趋势。成熟温度从5℃提高到15℃时,牦牛乳硬质干酪的水溶性多肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和血管紧张素转换酶的抑制作用呈加强趋势。

人牙胚釉原蛋白成熟肽基因的克隆

目的:克隆人釉原蛋白成熟肽编码区基因片断,并构建含有该基因的重组表达质粒。方法:从引产胎儿牙胚组织中抽提总RNA,以Oligo(dt)为引物,逆转录合成牙胚cDNA利用PCR,从cDNA中扩增出人釉原蛋白成熟肽编码序列(约540bp),所得目的基因片断插入表达载体质粒PQE30,转化到大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆,抽提重组质粒DNA,通过PCR、酶切和核苷酸序列分析,鉴定阳性克隆。结果:样品质粒测序证实,质粒PQE30中插入的基因片段与人釉原蛋白成熟肽基因序列完全相同。结论:从人胚胎的牙胚组织中克隆到釉原蛋白成熟肽编码序列,成功构建含有人釉原蛋白成熟肽基因的重组表达质粒。

釉成熟蛋白多肽多克隆抗体的制备和应用

目的制备兔抗鼠釉成熟蛋白(amelotin)的多克隆抗体并进行鉴定和应用。方法对amelotin的蛋白质序列进行分析,选取一段氨基酸序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联免疫新西兰大白兔,制备多肽抗体,ELISA检测抗体效价,Western blot法分析抗体特异性。免疫组织化学技术观察amelotin在小鼠下颌组织的表达情况。结果制备的兔抗amelotin抗体效价为1∶1 000 000,特异性高。免疫组织化学染色结果显示amelotin在3、7 d小鼠的磨牙釉质全层有强表达,并且在7 d小鼠下颌下腺的导管上皮细胞质中也有表达。结论成功制备了效价高、特异性好的兔抗amelotin抗体。

Hsp70-H22肿瘤细胞肽复合物与树突状细胞成熟的关系

探讨热休克蛋白 70 (Hsp70 ) - H2 2肽复合物与小鼠骨髓来源的树突状细胞 (dendritic cell,DC)成熟之间的关系。采用 GM- CSF、IL- 4刺激培养小鼠骨髓细胞 ,增殖产生大量 DCs;从 H2 2肝癌细胞中获取肿瘤细胞肽 ,体外与Hsp70进行结合 ,结合产物修饰 DC,通过细胞因子检测试剂盒和流式细胞仪对修饰的 DCs上清液和 DCs膜表面分子进行检测。发现 Hsp70 - H2 2肽复合物修饰的 DCs大量分泌 IL- 12、TNF- α、IL- 1β等细胞因子 ,并且高表达主要组织相容性 类抗原 (MHC 类 )、 CD80、 CD40等分子 ,而单独的 Hsp70或 H2 2肽则不具有此作用。结果提示 :Hsp70 - H2 2肽复合物可诱导 DC成熟 ,这种成熟的

白纹伊蚊和埃及伊蚊防御素(defensin)成熟肽基因克隆及结构推测

应用PCR技术从白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组中扩增出defensin成熟肽基因并对其分子生物学特性进行分析 ,发现埃及伊蚊 (BoraBora株、海口株 )、白纹伊蚊 (成都株、宜兴株、广州株 )推导的氨基酸序列与埃及伊蚊defensinA相同 ;通过Chou Fasman预测法对defensinA成熟肽的二级结构进行预测 ,可以看出在defensin成熟肽氨基酸序列的 15～ 2 3位有一个α 螺旋 ,35～ 39位有一个 β 折叠 ,32～ 34位有一个转角 ;