miR375过表达下调Nit-1细胞中肌侵蛋白的表达

目的为研究mi R375对肌侵蛋白(MTPN)表达的影响,探寻mi R375在糖尿病中的作用。方法该研究用质粒p AAV-mi R375转染Nit-1细胞48 h后,分别通过Real time RT-PCR和Northern Blot检测Nit-1细胞中mi R375的表达,Western Blot检测Nit-1细胞中MTPN蛋白的表达。结果在转染p AAV-mi R375的Nit-1细胞中mi R375的表达明显升高,是转染空质粒p AAV-MCS和未转染的6倍。MTPN蛋白的表达与转染了空质粒p AAV-MCS和未转染的Nit-1细胞相比,明显下降。结论在Nit-1细胞中mi R375过表达引起了MTPN蛋白表达下调,推测mi R-375可能是通过调节MTPN基因的表达来调控胰岛素分泌的,从而影响体内血糖的浓度。

肌侵蛋白起始心脏肥厚机制的研究进展

肌侵蛋白是12kDa的锚蛋白重复序列(ANK)蛋白,是最小的(ANK)2重复蛋白,ANK结构域使其能介导蛋白之间以及蛋白与核酸之间的相互作用。肌侵蛋白在哺乳动物的组织中广泛表达并能刺激心肌细胞的生长和心肌蛋白的合成。它最初是在肥厚和患有心肌病的心脏中被鉴定,起始心脏肥厚的过程,并最终导致心力衰竭(心衰)。近来的研究表明核转录因子-kappaB(NF-κB)参与心脏重塑和心衰的病理过程,而肌侵蛋白通过与NF-κB蛋白相互作用活化NF-κB信号途径激活心脏肥厚基因的表达。

心肌细胞中微小核糖核酸let-7c对肌营养素基因表达的调控作用

目的:探讨心肌细胞中微小核糖核酸(mi R)let-7c(mi R-let-7c)对肌营养素基因表达是否具有调控作用以及可能的作用机制。方法:首先构建携带肌营养素基因3'非编码区(3'-UTR)片段的荧光素酶报告基因载体,与mi R-let-7c前体共转染Hela细胞,双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性以验证mi R-let-7c与肌营养素基因的靶向调控关系。进而培养大鼠心肌细胞H9c2,Taqman实时定量聚合酶链式反应(PCR)法检测mi R转染效果,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测mi R-let-7c及mi R-let-7c抑制物转染心肌细胞后肌营养素蛋白表达,以及心肌肥厚相关信号通路分子核转录因子-κB(NF-κB)的活性变化。结果:荧光素酶活性实验结果表明,与重组荧光素酶报告基因表达载体(p MIR-MTPN)+mi R前体阴性对照组相比,p MIR-MTPN+mi R-let-7c前体组荧光素酶活性显著降低[(59.30±9.90)%vs(98.10±15.10)%]。Western blot结果表明,mi R-let-7c前体组与mi R阴性对照组相比,肌营养素蛋白表达水平显著降低([0.28±0.05)vs(0.90±0.09)],此外,NF-κB蛋白水平显著降低([0.25±0.06)vs(0.75±0.07)];相反,mi R-let-7c抑制物组与抑制物阴性对照组相比,肌营养素蛋白表达水平显著升高[(1.14±0.09)vs(0.44±0.09)],同时,NF-κB蛋白水平也显著升高[(1.09±0.05)vs(0.71±0.06)],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-let-7c能够通过作用于3'UTR区域,抑制肌营养素基因表达,并影响心肌肥厚关键信号通路分子NF-κB的活性。

微小RNA-375调控NIT-1胰岛细胞脂性凋亡

目的 探讨提高或降低内源性微小RNA-375(miRNA-375)的水平是否影响小鼠胰岛β细胞NIT-1的脂性凋亡.方法 以500μmol/L长链不饱和游离脂肪酸棕榈酸孵育NIT-1 48 h,建立脂性凋亡模型,并以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测重组胰岛素样生长因子1(V1)表达水平.将NIT-1分为:空白组(正常培养细胞),空转组(等量lipo 2000),阴性对照miRNA组(等量lipo 2000+阴性对照miRNA),miRNA-375组(等量lipo 2000+miRNA-375)(提高内源性miRNA-375水平),2'-O-me-375组(等量lipo 2000+2'-O-me-375)(降低内源性miRNA-375水平).在2 ml转染体系,通过转染脂质体lipo 2000 5 μl(空白组不加),以80 nmol/L miRNA或对照物(空转组不加)转染NIT-1,72 h后各组分别予500μmoL/L棕榈酸孵育48 h.72 h后各组分别予500μmol/L棕榈酸孵育48 h.以Hochest 33342染色和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测并计算凋亡率,以Western blot检测V1表达水平.结果 棕榈酸组凋亡细胞数明显比对照组增多,而V1表达水平比对照组下降约66.8%(t=5.051,P＜0.0001).与其他三组比较,miRNA-375组脂性凋亡率最高,比空白组升高73.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高1.47倍(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001).miRNA-375组V1表达水平降低,比阴性对照miRNA组降低56.06%(P＜0.05).而另一方面,与其他三组比较,2'-O-me-375组脂性凋亡率最低,比空白组降低64.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组下降49.6%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P=0.001).2'-O-me-375组V1表达水平最高,比空白组升高5.33倍(P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高75.9%(P=0.021).结论 棕榈酸诱导小鼠胰岛细胞凋亡伴有V1表达水平下降;miRNA-375参与调节小鼠胰岛β细胞的脂性凋亡.

抑制miR-375降低NIT-1胰岛β细胞脂性凋亡

目的探讨抑制内源性微小RNA-375（miR-375）是否影响NIT-1胰岛β细胞的脂性凋亡。方法将NIT-1细胞分为4组：空白组（无脂质体）、空转组（脂质体）、阴性对照miRNA组（脂质体＋阴性对照miRNA）、2＇-O-me-375组（脂质体＋2＇-O-me-375，抑制内源性miR-375的作用）。转染72h后，各组细胞分别以500μmol／L棕榈酸孵育48h。以Hochest 33342染色和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡，以Western印迹法检测miR-375靶基因肌营养素（myotrophin，V1）的表达。结果与其他3组比较，2’-O-me-375RNA组NIT-1脂性凋亡率最低（P〈0．01），同时V1表达水平最高（P〈0．01）。结论抑制内源性miR-375可降低胰岛β细胞的脂性凋亡。