粘细菌Myxococcus sp.CYD-1海藻糖合酶基因克隆及酶学特性分析

【目的】海藻糖合酶(trehalose synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。本文以粘细菌Myxococcus sp.CYD-1为材料,挖掘新的海藻糖合酶资源。【方法】以菌株CYD-1基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因MCTs,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni^(2+)-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH、温度和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株CYD-1基因组中克隆到一个编码海藻糖合成酶的基因MCTs。MCTs全长1659 bp,编码一个552个氨基酸的蛋白,分子量大小为65 kU。氨基酸序列分析表明MCTs与来源于Myxococcus sp.V11的海藻糖合酶相似性为92.36%,与其他已报道的海藻糖合酶有较大差异。MCTs具有高度保守的基序202DAVPYL207,244EANQ247和307RNHDEL312,以及活性中心三联体Asp202-Glu244-Asp310,三维建模结果显示MCTs的催化结构域具有典型的(α/β)8桶状结构,表明MCTs归属于糖苷水解酶GH13家族。重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量可溶性表达后,通过Ni^(2+)-NTA将目的蛋白纯化至电泳纯。重组酶rMCTs最适反应温度为40℃,最适反应pH为6.5,最大比活力为105.6 U/mg。重组酶rMCTs在30℃下处理4 h,残留酶活为50%,但在65℃下处理1.5 h活力丧失。重组酶rMCTs在pH 5.0~8.0范围内有活性,在pH 6.0~7.5处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rMCTs有轻微的激活作用,Co^(2+)、Fe^(3+)、Cu^(2+)对重组酶rMCTs有抑制作用,其余金属离子对酶活力无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rMCTs有强烈的抑制作用,TritonX-100对rMCTs酶活力无显著影响。【结论】MCTs具有潜在的应用价值,丰富了海藻糖合成酶资源。