The Benzoylation of 6-Methyluracil and 5-Nitro-6-methyluracil

Methyluracil and 5-nitro-6-methyluracil react with variable molar quantities of benzoyl chloride in acetonitrile-pyridine at room temperature to give 1-N, 3-N-dibenzoyl-6- methyluracil 3b and 1-N-benzoyl-5-nitro-6-methyluracil 4b. The reactive rates of debenzoylation of 3b and 4b were investigated.

MNNG和佛波酯诱导建立结肠癌的恶性转化细胞模型

目的建立结肠癌的恶性转化细胞模型。方法以1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)为启动剂、佛波酯(PMA)为促癌剂,对永生化的正常人结肠上皮细胞(NCM460细胞)进行多代诱导处理。采用MTT实验、细胞克隆形成实验和细胞划痕实验鉴定NCM460细胞恶性转化的倾向性和恶性生物学特征,采用Western blot检测神经钙黏附蛋白(N-cadherin)、转化生长因子β1(TGF-β1)和表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白表达水平。结果正常NCM460细胞形态为梭形,排列有序,呈单层生长;诱导后的第30代NCM460细胞形态发生显著变化,大小不一,排列紊乱,呈团块状生长。正常NCM460细胞、第17代NCM460细胞、第30代NCM460细胞的增殖能力依次升高,克隆形成数量依次增多,48 h迁移距离和迁移率依次增加或升高(P<0.05)。第30代NCM460细胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1的蛋白表达水平高于正常NCM460细胞(P<0.05)。结论经过MNNG和PMA连续多代诱导处理后,NCM460细胞的生物学功能(增殖、克隆形成和迁移能力)发生明显改变,具备恶性细胞的生物学特征。该模型可用于结肠癌的发病机制和治疗方法研究。

甲基N-硝基亚硝基胍和视黄酸致ICR小鼠腭裂发育模型的建立

目的:建立发生率较高、畸形类型明确、易于获得并可用于不同类型化学物致腭裂发生机制研究的动物模型。方法:采用致突变性化合物甲基N 硝基亚硝基胍(MNNG)和非致突变性致畸物视黄酸(RA)作用于ICR小鼠(对照组采用溶剂),观察不同剂量和不同给药时间的胚鼠腭裂畸形发生率,确定诱导腭裂发生的最佳作用条件,并通过光镜、电镜等手段对其畸形特征作进一步分析。结果:孕10 d一次给予40 mg/kg MNNG所致腭裂的发生率为55.2%,一次给予80 mg/kg RA腭裂发生率几乎达100%;光镜结果显示这2种化学物诱导的腭裂均为小腭;电镜结果表明孕16 d对照组腭中嵴上皮细胞表面有大量的丝状伪足而实验组中则无。结论:成功建立了可供两类不同腭裂发生分子机制研究的动物模型,为进一步研究腭裂畸形的分子机制奠定了基础。

N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定

运用ｍＲＮＡ差异显示（ＤＤ－ＰＣＲ）技术，通过２６对锚定及任意引物组合显示基因的差异表达情况，分离了７个表达有差异的片段．其中３个片段的相关基因属于对Ｎ－甲基－Ｎ′－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）处理的初级反应基因，２个属于次级反应基因．另有２个片段的差异表达仅在蛋白合成抑制剂环己亚胺（ＣＨＭ）合并ＭＮＮＧ处理时才出现．反向缝隙印迹杂交分析印证了２个片段在ＤＤ－ＰＣＲ中发现的改变，同时分析的本实验室分离的２５个片段中，８个片段的变化被验证与ＤＤ－ＰＣＲ中的改变一致．序列分析结果显示这些片段与许多基因有高同源性，其中包括一些参与信息传导的基因．

MNNG对多杀菌素产生菌的诱变效应

多杀菌素(spinosad)是刺糖多孢菌Saccharopolyspora sptnosa发酵产生的次级代谢产物,有显著杀虫活性。采用N-甲基-N'硝基-N-亚硝基胍(MNNG)作为诱变因子对刺糖多孢菌的孢子进行诱变处理,以高效液相色谱方法检测多杀菌素的发酵产量。研究结果表明:诱变剂量为2mg/ml,诱变40min时多杀菌素产量有较大幅度提高。通过诱变最终得到5株产量分别比出发菌株提高61.1%、80.3%、128.1%、69.9%和77.8%的突变株。

烷化剂NTG诱变虾青素产生菌红法夫酵母的研究

虾青素是一种很有效的生物抗氧化剂和某些生物的天然着色剂，应用前景广阔。红法夫酵母是 生产虾青素的一个来源，优点颇多。天然菌株虾青素产量较少，缺少实用价值。实验采用烷化剂ＮＴＧ 诱变红法夫酵母，筛选出类胡萝卜素产量高的诱变株。用薄层层析对红法夫酵母产生的色素及其皂 化产物进行分析，并对各个成分的扫描光谱进行了比较。认为红法夫酵母产生的类胡萝卜素成分主 要是虾青素及虾青素二酯，还有一部分β－胡萝卜素。同时，还对虾青素产生的时相和ＢＨＴ对虾青素 光分解的保护作用进行了初步研究。

MNNG、CDCA构建胃黏膜上皮细胞GES-1肠化生模型的可行性

目的探讨N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、鹅脱氧胆酸(CDCA)构建胃黏膜上皮细胞GES-1肠化生模型的可行性。方法体外培养GES-1细胞,分别给予不同浓度CDCA、MNNG处理24 h,采用CCK-8法检测450 nm波长处各孔光密度(OD)值,确定CDCA、MNNG对GES-1细胞具有生长抑制作用,二者的10%抑制浓度(IC10)分别为0.14、51.89μmol/L。另取GES-1细胞随机分为CDCA组、MNNG组,分别加入IC10的CDCA、MNNG,同时设未加药物处理的细胞为对照组,培养24 h时采用实时荧光定量PCR法检测黏蛋白1(MUC1)mRNA、黏蛋白2(MUC2)mRNA及尾型同源框转录因子2(CDX2)mRNA相对表达量。结果与对照组比较,CDCA组、MNNG组MUC1 mRNA相对表达量均降低,MNNG组MUC2 mRNA相对表达量降低,组间比较P均<0.05。三组间CDX2mRNA相对表达量比较P>0.05。结论 CDCA、MNNG可抑制胃黏膜上皮细胞生长,可用于构建胃黏膜上皮细胞的肠化生模型;下调胃特异性基因MUC1表达、上调肠特异性基因CDX2表达可能是二者的作用机制。

MNNG加吐温20和维生素D_3对大鼠前胃的影响

目的 研究胃癌发生、发展过程中，间质组织中血管反应与肿瘤的关系．方法 经水摄入Ｎ－ 甲基－ Ｎ１ － 基－ Ｎ － 亚硝基胍（ ＭＮＮＧ）和表面活性剂（ 吐温２０） 诱发大鼠肿瘤，饲料中添加维生素Ｄ３（ＶｉｔＤ３） 对肿瘤进行预防． 每８ ｗｋ 处死大鼠７ 只，３２ ｗｋ 实验结束．结果 ｗ ｋ １６ 实验组大鼠前胃鳞状上皮形态主要以血管密度增加、血管内皮细胞增生，３２ ｗｋ（ ＭＮＮＧ） ＋ 表面活性剂和ＶｉｔＤ３ 组肿瘤发生率高于ＭＮＮＧ 组（１０ ％ ） ，肿瘤发生率为６５ ％ ．结论 该组动物诱癌实验表明，肿瘤形成前主要以血管新生、血管ＥＣ 增生为主的病理性变化．

甲基硝基亚硝基胍诱发的遗传不稳定vero细胞DNA体外复制的保真度

利用在猴肾ｖｅｒｏ细胞抽提物中建立的ＤＮＡ体外复制系统，对穿梭质粒ｐＺ１８９ＤＮＡ进行有效的复制后，将复制产物转化至Ｅ．ｃｏｌｉＭＢＭ７０７０，观察ｐＺ１８９质粒ＤＮＡ中突变靶基因ｓｕｐＦｔＲＮＡ基因突变的情况．在烷化剂甲基硝基亚硝基胍（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ′－ｎｉｔｒｏ－Ｎ－ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）诱发的遗传不稳定（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ）ｖｅｒｏ细胞胞浆抽提物中进行ｐＺ１８９质粒ＤＮＡ复制，发现经过体外复制的ｐＺ１８９质粒中ｓｕｐＦｔＲＮＡ基因突变率高出对照组５－８倍（Ｐ＜０．０５）。

半夏泻心汤对MNNG诱导大鼠前胃鳞癌的防治作用

目的观察半夏泻心汤对N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG诱导大鼠前胃鳞癌的防治作用。方法将140只雄性SD大鼠随机分为3组,空白组20只、模型组100只、模型中药组20只,采用MNNG联合多因素造模。每4周抽检模型组大鼠4只,观察前胃黏膜组织学变化,确定造模是否成功。造模成功后抽检各组大鼠,并将剩余模型组39只大鼠随机分为4组,模型对照组9只,半夏泻心汤高、中、低剂量组各10只,分别给予0.9%生理盐水、2.29、1.375、0.6875 g/m L的半夏泻心汤灌胃,10 m L/kg,1次/天,连续12周。40周末,处死全部大鼠,观察前胃黏膜组织学变化。结果 28周末前胃鳞状上皮增生、异型增生、鳞癌发生率,空白组为5%、5%、0,模型组为100%、83.3%、50%,模型中药组为0、0、0。40周末前胃鳞状上皮增生、异型增生、鳞癌发生率,模型对照组为100%、100%、77.8%,高剂量组为100%、85.7%、57.1%,中剂量组为100%、44.5%、22.3%,低剂量组为100%、77.8%、66.7%。结论半夏泻心汤对MNNG多因素造模法诱发大鼠前胃鳞癌的发生具有一定的防治作用。

低浓度N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍对HeLa细胞DNA聚合酶及拓扑异构酶Ⅱ α mRNA表达水平的影响

利用定量逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法，研究了低浓度甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）对ＨｅＬａ细胞ＤＮＡ聚合酶（Ｐｏｌα，β，δ，ε）及拓扑异构酶Ⅱα（ＴｏｐⅡα）ｍＲＮＡ表达水平的影响．发现经０．２μｍｏｌ·Ｌ－１ＭＮＮＧ处理２．５ｈ后，ＨｅＬａ细胞ＰｏｌβｍＲＮＡ水平在６－２４ｈ内升高约１倍，而Ｐｏｌα，δ，ε及ＴｏｐＩαｍＲＮＡ水平则无明显改变．提示ＰｏｌβｍＲＮＡ水平改变可能参与ＭＮＮＧ诱发细胞遗传不稳定的发生．

Survivin反义核酸协同紫杉醇的体外及大鼠体内抗肿瘤作用

目的研究转染生存蛋白survivin反义寡核苷酸的抗肿瘤作用,对大鼠胃癌模型形成的干预作用、机制及是否与紫杉醇间有协同作用。方法在脂质体介导下进行survivin反义寡核苷酸的体外转染,以WesternBlot检测survivin蛋白表达,以MTT法检测转染survivin反义寡核苷酸及联合紫杉醇对胃癌BGC823细胞生长增殖的影响;以高盐饲料和甲基硝基二硝基胍(MNNG)诱导大鼠发生胃癌,造模中期分别腹腔注射脂质体包裹的survivin反义寡核苷酸、紫杉醇或两者联用,检测造模结束时各组大鼠胃癌的发生率、肿瘤组织中Brdu标记率及凋亡指数。结果Survivin反义寡核苷酸能明显抑制survivin蛋白表达,并抑制BGC823细胞的生长,其IC50约350nmol/L;survivin反义寡核苷酸与紫杉醇联合能显著降低其IC50值,起到协同抗肿瘤作用。造模结束时对照组(C)、紫杉醇组(T)、反义寡核苷酸组(A)、反义寡核苷酸联合紫杉醇组(AT)胃腺癌发生率分别为90%、78.6%、73.3%和50%,AT组的胃癌发生率显著低于对照组(P<0.05),两个单独治疗组胃癌发生率均低于对照组,但无统计学差异(P>0.05);AT组胃癌的BrdU标记率(10.2±4.7)显著低于对照组(18.7±5.5,P<0.05)及T、A两个单独治疗组(分别为16.0±5.8和15.4±5.2,P<0.05);AT组胃癌的凋亡率(1.71±0.41)显著高于对照组(0.91±0.14,P<0.01)及T、A单独治疗组(1.19±0.42、1.29±0.43,P<0.05)。结论Survivin反义寡核苷酸能抑制BGC823细胞生长,与紫杉醇有协同抗肿瘤作用;腹腔注射survivin反义寡核苷酸与紫杉醇能协同抑制胃癌形成,与促进凋亡和抑制细胞增殖有关。Survivin是抗肿瘤基因治疗的良好靶点。

用高通量实时荧光PCR技术研究低浓度MNNG诱发的细胞基因应答反应

目的:研究低浓度N-甲基-N-硝基-N-甲基亚硝基胍对人羊膜FL细胞部分基因表达的影响,以助于阐明MNNG引起细胞应答反应的基因及其调控机制。方法:用ABI公司的高通量实时荧光定量PCR方法,检测FL细胞在0.2μmol/LMNNG处理后基因表达发生的改变。数据用ABI公司的SDS2.1软件分析。结果:MNNG处理后,在检测的95个基因中,29个基因表达发生改变,其中14个基因下调2倍以上,15个基因下调在1.5-2倍之间;其中有4个基因与细胞周期相关,6个基因与信号转导相关,6个基因与转录调节相关。结论:在低浓度MNNG攻击后,FL细胞的基因表达发生了显著的变化。

中华猕猴桃的防癌作用(三)在模拟人胃液中对N-亚硝酰胺合成的阻断作用——Ames试验

本文用Ames试验的方法研究了中华猕猴桃汁对N-亚硝酰胺体外合成的阻断作用。 在模拟人胃液的条件下,亚硝酸钠和甲基硝基胍能反应生成N-甲基-N′-硝基-N亚硝基胍,在Ames氏平皿掺入试验中引起鼠伤寒沙门氏菌TA100菌株的突变反应,有明显的剂量反应关系。当亚硝酸钠浓度为50mM,甲基硝基胍为100mM时,突变菌落数高达4327个/皿,为自发回变的19.94倍。中华猕猴桃汁能阻断N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍合成,抑制突变反应。在亚硝酸钠浓度为22.2mM,甲基硝基胍为44.4mM时,猕猴桃汁能完全阻断N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的合成,致突变反应为阴性。而不加猕猴桃汁的同浓度反应体系引起的突变反应为自发回变的12.59倍。桃汁组低于此浓度的反应体系结果皆是阴性,而对高于此浓度的反应体系,猕猴桃汁不能完全阻断N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍合成,但能明显抑制突变反应。对中等浓度的反应体系,与桃汁含量相同的抗坏血酸溶液亦能部分阻断N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍的合成,但作用低于猕猴桃汁。实验结果证明猕猴桃汁阻断N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍体外合成的作用明显优于同浓度抗坏血酸溶液。 在相同实验条件下,单独的亚硝酸钠或甲基硝基胍均无致突变作用。经薄层层析方法定性分析,反应生成物是N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍。

魔芋精粉对MNNG诱发小鼠肺癌的预防作用

取LACA小鼠370只,分为两批,每批又分为正对照(MNNG)、魔芋精粉(R.A.K.)、复合(MNNG+R.A.K.)及空白对照(C)4个组。正对照组每5天于小鼠尾静脉注射MNNG250μg一次,共7次;魔芋精粉组按8％(W/W)魔芋精粉加入92％普通饲料混匀,长期喂养;复合组,在给予MNNG同时,按魔芋精粉组喂养;MNNG组及C组只长期喂普通饲料。实验结果表明,魔芋精粉对MNNG诱发小鼠肺癌可产生不同程度的预防作用,不仅使肿瘤发生数目、每例平均肿瘤数目和小鼠患肿瘤数都大量减少,发癌率从79.75％下降到20.00％,而且延长动物寿命,同时在肿瘤类型构成比上,恶性(腺瘤恶变)减少,无腺癌发生,良性腺癌相对增加。实验结果重复性好,无明显不良作用。

dNTP库与细胞转化间关系的研究

采用反相ＨＰＬＣ法定量测定了ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞经烷化突变剂甲基丙烯酸环氧丙酯（ＧＭＡ）和Ｎ－甲基－Ｎ′－硝基－Ｎ－亚硝基胍（ＭＮＮＧ）转化处理后胞内脱氧核糖核苷三磷酸含量（ｄＮＴＰ库）的变化及最终形成的Ⅲ型转化细胞中的ｄＮＴＰ库，发现转化处理后ｄＮＴＰ库的变化规律相似：均表现为脱氧嘌呤核苷三磷酸库与脱氧嘧啶核苷三磷酸库间差距明显扩大；转化细胞中ｄＮＴＰ库也明显异于正常细胞，提示ｄＮＴＰ库可能在细胞转化进程中起着重要作用。

决明子水提物干预N-硝基-L-精氨酸甲酯诱导高血压模型大鼠血压的变化

背景:高血压现代诊疗理念是通过降压治疗保护靶器官、改善临床症状与最大程度减少临床事件。决明子在动物实验和临床实践中有降压作用,但是其是否有助于改善高血压血管功能障碍、氧化应激和终末器官损害仍有待于进一步研究。目的:评估决明子水提物对N-硝基-L-精氨酸甲酯诱导的高血压大鼠的降压功效。方法:灌胃N-硝基-L-精氨酸甲酯构建高血压大鼠模型,然后给予决明子水提物[500 mg/(kg·d)]治疗,均连续灌胃4周,1次/d。每周测量1次血压、心率。最后一次灌胃给药24 h后,检测血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶、尿素、血肌酐、脂质谱以及肝脏和肾脏中丙二醛、一氧化氮、还原型谷胱甘肽水平、血管紧张素转化酶活性。通过免疫组化和实时定量PCR分析大鼠肾脏组织中内皮型一氧化氮合酶、诱导型一氧化氮合酶蛋白及基因表达。结果与结论:与高血压模型组相比,决明子水提物治疗4周有效降低了高血压大鼠的平均动脉压、舒张压、收缩压(P<0.05),并改善肝脏和肾脏标志物、脂质分布和氧化状态。此外,决明子水提物显著降低了高血压大鼠肝脏和肾脏中血管紧张素转化酶活性(P<0.05)。在决明子水提物处理的大鼠肾脏中,内皮型一氧化氮合酶的基因和蛋白表达均显著高于高血压模型组。以上结果表明,决明子水提物显示出相当大的降压潜力,其降压机制包括上调内皮型一氧化氮合酶表达、抗氧化和血管紧张素转化酶抑制作用。

低浓度MNNG激活转录因子

目的 :为了进一步研究 N-甲基 - N’-硝基 - N-亚硝基胍 (MNNG)引起的非定标性突变的发生机制 ,观察了低浓度 MNNG对转录因子 NF- κB、CREB、AP- 1和 c- Myc的影响。方法 :采用分泌型碱性磷酸酶报告基因和瞬时转染实验检测转录因子活性。结果 :经 0 .2 μmol/L MNNG处理后 ,转录因子 CREB活性是溶剂对照组的 1.4倍 (P<0 .0 5 ) ,AP- 1和 NF- κB活性均为溶剂对照组的 1.3倍 (P<0 .0 5 ) ;而 c- Myc的活性在对照组和 MNNG处理组都较低。结论 :低浓度 MNNG可以激活转录因子 AP- 1、CREB和 NF- κB,对 c- Myc则无明显激活作用 ,提示一些转录因子的激活可能参与了 MNNG引起的非定标性突变发生过程。

NO水平下降通过氧化应激引起人胎盘滋养细胞凋亡

目的探讨一氧化氮(NO)水平下降诱导人胎盘滋养细胞凋亡的可能机制。方法体外培养人胎盘滋养细胞株(HTR-8),分别加入10、100、500、1 000μmol·L-1L-NAME,并设置对照组(0μmol·L-1L-NAME),孵育48 h;四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测L-NAME对细胞存活率的影响;采用硝酸还原酶法测定细胞中NO的含量;利用透射电镜、流式细胞术和Annexin-V FITC染色检测L-NAME对HTR-8细胞凋亡的影响;Fe3+还原比色法检测总抗氧化能力(T-AOC)、黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性及硫代巴比妥酸比色法测定MDA含量。结果与对照组比较,100、500、1 000μmol·L-1L-NAME组细胞存活率及NO水平明显降低(P<0.05,P<0.01);Annexin-V FITC染色和流式分析均显示L-NAME能诱导细胞凋亡,并且呈剂量依赖性;NO水平与细胞凋亡数呈负相关(r=-0.5210);透射电镜结果显示:与对照组比较,实验组细胞核形态不规则,核膜固缩呈不规则状,染色质凝集或边集,线粒体肿胀或浓缩、嵴断裂或溶解,甚至消失,形成空泡,尤其在100μmol·L-1L-NAME组可见凋亡小体;同时,HTR-8细胞内T-AOC、SOD水平明显降低(P<0.05),MDA的含量明显升高(P<0.05);细胞凋亡数与T-AOC(r=-0.3212)、SOD(r=-0.2779)水平均呈负相关,与MDA(r=0.2807)含量呈正相关。结论氧化应激在NO水平降低引起的人胎盘滋养细胞凋亡中起重要作用。

丁基苯酞对原代培养胎大鼠皮层神经细胞外液NO及胞浆内cGMP水平的影响

用分光光度法和放射免疫分析法分别检测ＮＯ及ｃＧＭＰ水平，同时观察ｌ丁基苯酞（ｌＮＢＰ）和ｄ丁基苯酞（ｄＮＢＰ）对原代培养的胎大鼠皮层神经细胞外液ＮＯ及胞浆内ｃＧＭＰ水平的影响。结果表明，ｄＮＢＰ（０１～１００μｍｏｌ·Ｌ－１）对低糖低氧条件下或含Ｎ甲基Ｄ门冬氨酸（ＮＭＤＡ）或含ＫＣｌ的培养基中皮层神经细胞外液ＮＯ及细胞内ｃＧＭＰ水平明显升高，而ｌＮＢＰ（０１～１００μｍｏｌ·Ｌ－１）则能明显降低ＮＯ和ｃＧＭＰ水平。提示：ｄＮＢＰ和ｌＮＢＰ对低糖低氧，ＮＭＤＡ或ＫＣｌ诱导的ＮＯ释放和ｃＧＭＰ生成有相反的作用。