N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶的功能与机制

N-乙酰氨基葡萄糖苷内切酶(endo-beta-N-acetylglucosaminidase,ENGase)广泛分布于各种生物中,主要通过降解错误折叠的糖蛋白,参与细胞和生命的调控。ENGase也是糖链编辑的有效工具酶,可专一性水解游离寡糖链及糖肽或糖蛋白上核心五糖的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)之间的β-14糖苷键。其水解产物是寡糖链和一个GlcNAc,或带有一个GlcNAc的糖肽或糖蛋白。本文对ENGase的发现、分布、蛋白质结构、酶学反应及生物学功能进行阐述,为ENGase的生物学研究提供思路,为糖生物学与糖组学的应用研究奠定基础。

^(99m)Tc-DTPA肾动态显像结合尿N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶可较好诊断中老年原发性高血压患者的早期肾损害

目的探讨99锝-二乙三胺五醋酸(^(99m)Tc-DTPA)肾动态显像方法与尿N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶(尿NAG)检测在中老年原发性高血压早期肾损害中的临床意义。方法选取80例中老年原发性高血压患者为观察组,年龄63.0±8.6岁,按血压水平分为高血压1级组(H1组)、高血压2级组(H2组)、高血压3级组(H3组);根据患者尿微量白蛋白/尿肌酐水平分为正常白蛋白尿组(NA组)53例,微量白蛋白尿组(MA组)27例;同时选取20例中老年健康体检者为对照组(NC组),年龄61.1±9.6岁。所有入选者均行肾动态显像,计算肾小球滤过率(GFR)、高峰时间(t_(p))、半排时间(t_(1/2)),留取随机清洁中段尿液检查尿NAG,空腹抽血测血胱抑素C(Cys-C)和血肌酐。上述指标按高血压级别进行组间比较,同时将NA、MA与对照组进行组间比较。结果高血压各组与对照组相比,GFR均降低,t_(p)、t_(1/2)延长,尿NAG升高;高血压组间比较,随着血压水平的升高,GFR降低,t_(p)、t_(1/2)延长,尿NAG、Cys-C升高(P<0.05);H2、H3组Cys-C较对照组升高(P<0.05)。H1组Cys-C与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。高血压患者NA、MA组与对照组比较,NA与MA组GFR降低,t_(p)、t_(1/2)延长,尿NAG及Cys-C升高(P<0.05)。NA、MA组血肌酐与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。MA与NA组比较,MA组较NA组GFR降低,t_(p)、t_(1/2)延长,尿NAG及Cys-C升高(P<0.05),两组间血肌酐差异无统计学意义(t=0.885,P>0.05)。高血压组GFR与尿NAG呈负相关(t=-0.39,P<0.01)。结论肾动态显像及尿NAG对原发性高血压患者早期肾损害具有较好诊断价值。

肾损伤标志物N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测方法的研究进展

药物引起的肾损伤是一个备受关注的公共健康问题,目前对于早期肾损伤的临床诊断缺少有效的技术手段,导致疾病不能得到及时治疗,最终危及患者的生命安全。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAG)是一种新型的肾脏损伤的生物标志物,在早期肾损伤时尿液中的NAG活度即可发生显著变化,因此,开发NAG的精确、批量、低成本检测技术,对于肾脏疾病的早期诊断和治疗具有重大意义。为此,中外学者在近几十年内做了大量的研究工作。综述了NAG检测方法的研究进展,分析了各种方法的优势和不足,最后讨论了NAG检测技术的发展方向。

棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

以棉铃虫Helicoverpa armigera蛹为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-200分子筛柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶制剂.纯酶的比活力为2 678.79 U/mg.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-β-D-GlcNAc)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:酶的最适pH为5.63,最适温度为55℃.该酶在pH 4～8区域较稳定,而在pH>8时能迅速失去活力;在50℃以下处理30 min,酶活力仍保持稳定,高于50℃,酶很快失去活力.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.16 mmol/L,最大反应速度Vm为10.73 μmol·L-1·min-1.酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为66.24 kJ/mol.

有机溶剂对南美白对虾N-乙酰-βD-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

研究了几种有机溶剂对南美白对虾(Penaeus vannamei)N-乙酰--βD-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响.结果表明:甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙二醇和丙三醇对NAGase的作用均表现为低浓度时对酶有激活作用,随着浓度的升高,激活作用减弱并速转为抑制作用;二甲亚砜和二氧六环对酶的抑制作用呈现明显的浓度效应,随浓度增大酶活力迅速下降.进一步研究二甲亚砜的抑制作用动力学,结果表明:二甲亚砜对酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为混合型抑制类型,抑制常数KI=0.27 mol/L,KIS=2.05 mol/L.

日本沼虾(Macrobrachium nipponense)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶初步纯化及部分性质

以日本沼虾内脏为材料，通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化，获得比活力为3000Umg^-1、纯化倍数为8．88倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂（NAGase）．以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物，研究酶催化底物水解的反应动力学，结果表明，酶的最适pH为6．0，最适温度为53℃．该酶在pH4．5—9．3区域较稳定，当pH〉9．3很快失活；在50℃以下处理30min，酶活力保持稳定，高于50℃，酶稳定性较差，75℃酶完全失活．酶促反应动力学符合米氏双曲线方程，测得米氏常数Km为0．165mmolL^-1，最大反应速度‰为6．55μmolL^-1min^-1．酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为63．55kJmol^-1．

猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的纯化与酶学性质研究

【目的】分离纯化猪精液碱性N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂,研究其理化性质。【方法】采用硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32阴离子交换柱层析、Sephadex G-100分子筛柱层析和CM-52阳离子交换柱层析方法,分离纯化猪精液的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶分子量测定;采用聚丙烯酰胺等电聚焦圆盘电泳法测定酶的等电点。【结果】经分离纯化获得比活力为17606.15U·mg-1、纯化倍数为270.53倍的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。酶催化对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(pNP-NAG)水解的最适pH为5.5,最适温度为50℃。该酶在pH 3.0～8.9区域较稳定;在45℃以下处理30min,酶活力保持稳定。酶分子中亚基的分子量为58.03 kD,等电点为9.42。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为1.94mmol·L-1,最大反应速度Vm为27.53 μmol·L-1·min-1。酶催化pNP-NAG反应的活化能为88.73 kJ·mol-1。【结论】本试验选用的分离纯化的方法是可行的。

金属离子对凡纳对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

本文报道了金属离子对凡纳对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 (EC3. 2. 1. 52)活力的影响.结果表明,Li+、Na+和K+等对该酶活力没有任何效应.Ca2+、Mg2+、Mn2+对该酶有激活作用,而Ba2+、Al3+、Fe3+、Zn2+、Co2+、Cd2+、Hg2+、Pb2+和Cu2+对该酶活力均具有一定的抑制作用.以Hg2+的抑制作用最显著,Hg2+含量为 1. 5mmol/dm3 时可使酶活力完全丧失.进一步研究Zn2+的抑制作用动力学,结果表明:Zn2+对该酶的抑制作用属可逆的非竞争性类型,抑制常数为11. 95mmol/dm3.

几种重金属离子对中华绒螯蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

本文研究了Cu2+、Pb2+、Zn2+和Ag+等重金属离子对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响。其结果表明:Cu2+、Pb2+和Zn2+对酶活力有不同程度的抑制作用,Cu2+和Zn2+对酶的抑制作用均表现为非竞争性抑制类型,Cu2+和Zn2+对酶的抑制常数(KI)分别为1.25mmol/L和8.10mmo/L;Pb2+对酶的抑制作用表现为混合型抑制类型,其对酶的抑制常数KI与KIS分别为10.44mmol/L和2.18mmol/L。Ag+对酶的效应为先激活后抑制,其抑制作用表现为反竞争性抑制,Ag+对结合酶(ES)的抑制常数KIS为204.51mmol/L。

番鸭(Cairina moschata)睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的提取及性质研究

以番鸭睾丸为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-32离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为19.18 U/mg、纯化倍数为6.46倍的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学。结果表明:酶的最适pH为5.6,该酶在pH3.0～7.6区域较稳定,而在pH>7.6能很快失活;酶的最适温度为55℃。当温度为80℃时,酶完全失活。在40℃以下处理30 min,酶活力保持稳定,高于45℃,酶稳定性较差。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.215 mmol/L,最大反应速度Vm为5.54μmol/L.min。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为69.05kJ/mol。金属离子对酶的效应试验表明:高浓度的Na+和K+对酶有抑制作用;Mg2+对酶有轻度激活作用,Cu2+、Pb2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+对酶活力有不同程度的抑制作用;Al3+对酶有抑制作用。

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究

本研究以中华绒螯蟹内脏为材料,经过硫酸铵沉淀分级分离、两次DEAE-32离子交换柱层析和Sephadex G-100分子筛柱层析纯化,获得比活力为4490.79U/mg、纯化倍数为28.07倍的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶制剂。酶分子中各亚基的分子量分别为121.219、8.63和73.48 kD,等电点为4.5。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,进行酶催化底物水解的反应动力学研究,结果表明:酶催化底物反应的最适pH为5.5,最适温度为45℃。该酶在pH4.9—9.3区域或40℃以下处理30min,酶活力保持稳定。酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为0.357 mmol/L,最大反应速度Vm为10.41μmol/L.min。酶催化pNP-β-D-GlcNAc反应的活化能为76.50kJ/mol。金属离子对酶的效应试验表明:Mg2+、Ca2+和Ba2+对酶活力没有影响。Na+对酶有激活作用,Li+、K+、Zn2+、Hg2+、Pb2+、Cu2+和Al3+对酶活力表现出不同程度的抑制作用。

铅镉联合作用对大鼠肾小管上皮细胞N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影响

目的 探讨铅镉联合作用对大鼠肾小管上皮细胞N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）的影响。方法 对原代大鼠肾小管上皮细胞提取、纯化、鉴定、培养后,以醋酸铅0、0.02、0.1、0.5 mmol/L,氯化镉0、0.001、0.004、0.02 mmol/L进行染毒,以及铅、镉2X2联合染毒,测定NAG变化。结果 单独染铅0.02、0.1 mmol/L,NAG活力与对照组之间差异无显著性,染铅0.5mmol/L时,差异有显著性;单独染镉0.001、0.004mmol/L,NAG活力与对照组之间差异无显著性,染镉0.02 mmol/L时,差异有显著性。当铅+镉以（0.02+0.001）、（0.02+0.004）、（0.1+0.001）、（0.1+0.004）mmol/L的剂量联合染毒时,4组NAG活力明显高于对照组和单独染铅组;除（0.1+0.001）mmol/L组外,其余3组NAG活力明显高于单独染镉组。结论 铅镉联合作用使大鼠肾小管上皮细胞NAG释放增加。

Zn^(2+)对棉铃虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与性质的影响

以棉铃虫蛹为材料,经分离纯化获得棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶制剂;研究了Zn2+对棉铃虫N乙酰βD氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.14)活力与性质的影响.结果表明,Zn2+对酶活力有抑制作用,酶活力丧失一半的Zn2+浓度(IC50)为1.3mmol/L.进一步研究Zn2+的抑制作用动力学,发现Zn2+对该酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为竞争型,抑制常数KI为1.158mmol/L.Zn2+不会影响酶的酸碱稳定性,但有Zn2+存在时,在30～40范围内,酶是稳定的,温度高于50℃后,随着Zn2+浓度的增加,酶的温度稳定性也相对增加.

丙酮对锯缘青蟹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与构象的影响

以丙酮为效应物,研究其对锯缘青蟹(Scylla serrata)N-乙酰--βD-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果表明:该酶的剩余活力随着丙酮浓度增大而呈指数下降,当丙酮浓度达25%,酶的剩余活力仅为20%,说明丙酮对青蟹NA-Gase有明显的失活作用.导致酶活力丧失50%的丙酮浓度为7.5%.在较低丙酮浓度(<10%)的失活是可逆的反应过程.动力学研究表明,该酶的失活过程属于混合型,并进一步测定游离酶(E)和酶底物络合物(ES)与丙酮的结合常数(KI和KIS),分别为4.06%和10.49%,KI<KIS,说明底物存在对酶被丙酮的失活作用有一定的保护作用.应用荧光发射光谱研究青蟹NAGase经丙酮微扰后的分子构象变化情况,结果表明:丙酮对酶分子构象有显著的影响,酶的内源荧光强度随丙酮浓度增大而降低,说明酶分子中的生色基团Trp和Tyr残基的微环境发生了变化.

产物类似物对南美白对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

以南美白对虾为材料,分离提纯N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶,研究产物NAG及产物类似物glu、gal、fru等对该酶催化水解pNp β D GlcNAc活力的影响.抑制强度次序为:NAG>gla>glu>suc>fru.研究抑制作用动力学,结果表明:NAG对酶的抑制作用表现为反竞争型,其抑制常数KIS为11.4mmol/L/;gal、glu、fru对酶的作用表现为竞争型抑制,抑制常数KI分别为0.709、0.747和2.94mol/L;suc对酶的抑制作用表现为非竞争型,抑制常数KI=KIS=2.58mol/L.

乙醇对南美白对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力与构象的影响

以南美白对虾为材料,分离提纯N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶,研究乙醇对该酶的活力与构象影响.结果表明,浓度低于22%(体积比)的乙醇对该酶活力有明显的激活效应;乙醇浓度为8%时,达到最大激活效应,酶活力为纯酶的180%.动力学研究表明,在30%浓度范围内,乙醇对酶活性的激活及抑制作用均是可逆的.乙醇低浓度下,Km值与Vmax值随乙醇浓度增大而增大;随着乙醇浓度的进一步升高,Km值保持不变,Vmax值则出现下降.紫外光谱与荧光光谱分析表明,低浓度乙醇对N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶的构象产生轻微的影响,而高浓度乙醇则使酶的整体构象趋于松散.由此可以推断,乙醇对该酶的活力影响是微扰酶活性中心产生激活效应与引发整体变构失活效应的共同作用结果.

文蛤抗癌多肽对N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

从文蛤体中分离纯化得到了抗癌多肽,研究该多肽对N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)活力的影响,结果显示文蛤抗癌多肽对该酶有明显的抑制作用.在本文中,我们将深入地研究其抑制作用机理和抑制效应类型,结果表明:随着文蛤多肽加入量的增大,该酶活力呈指数下降,测得导致酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC50)为112.9μg/cm3,该多肽对酶的抑制作用是一种可逆过程,抑制机理表现为混合型抑制类型,对游离酶(E)的抑制常数(KI)和酶-底物络合物的抑制常数(KIS)分别为77.03和697.44μg/cm3,说明文蛤抗癌多肽与游离酶的结合导致酶活力的丧失,明显的强于对酶-底物络合物的抑制效应,底物的存在对该酶被文蛤抗癌多肽抑制作用起了保护作用.

联合检测血浆血栓调节蛋白、尿Ⅳ型胶原及尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在糖尿病肾病早期诊断的临床意义

目的探讨血浆可溶性血栓调节蛋白(PTM)、尿Ⅳ型胶原(CⅣ)、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)在糖尿病肾病(DN)早期诊断中的价值。方法90例2型糖尿病(DM)患者按照莫杰森(Mogensen)法分类分为A组:正常白蛋白尿组;B组:微量白蛋白尿组;C组:大量白蛋白尿组。另选取30例健康人为对照组。分别采用酶联免疫吸附法、放射免疫法、比色法测定PTM、尿CⅣ、尿NAG含量,并行比较分析。结果PTM在A组、B组、C组分别为(4.72±0.28)μg/L,(7.26±0.39)μg/L和(10.95±0.60)μg/L,显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01);NAG在A组、B组、C组分别为(1.33±0.11)U/mmol,(3.13±0.25)U/mmol和(6.90±0.64)U/mmol,显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01);CⅣ在A组、B组、C组分别为(86.63±2.33)μg/24 h,(136.69±4.04)μg/24 h和(255.6±311.78)μg/24 h,显著高于正常对照组(P<0.05,P<0.01)。随着DN病情加重,3项指标逐渐升高。结论PTM、尿CⅣ、尿NAG可作为DN早期诊断的敏感指标。

蝾螺(Turbo cornutus Solander)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质的初步研究

以蝾螺内脏为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、SephadexG 200分子筛柱层析和两次DEAE SephadexA 50离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯的N 乙酰 β D 氨基葡萄糖苷酶酶制剂.纯酶的比活力为1448U·mg-1.酶的紫外特征吸收峰在275nm处,内源荧光发射峰在340nm处.以对 硝基苯 N 乙酰 β D 氨基葡萄糖为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学,结果表明:酶的最适pH为4.5,最适温度为45℃.该酶在pH3.5～6.0区域较稳定,而在pH>7能很快失活;在40℃以下处理30min,酶活力保持稳定,高于40℃,酶稳定性较差,很快失活.酶促反应动力学符合米氏双曲线方程,测得米氏常数Km为3.13mmol·L-1,最大反应速度Vm为17.68μmol·L-1·min-1.

养殖常用抗菌药物对凡纳滨对虾外壳膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

研究几种抗菌药物对凡纳滨对虾壳膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC 3.2.1.52)活力的影响.结果表明,诺氟沙星和磺胺甲噁唑对该酶活力有不同程度的抑制作用,盐酸环丙沙星对此酶有激活作用,而青霉素钾、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、磺胺嘧啶等对酶活力基本上没有影响;磺胺甲噁唑的抑制作用最为显著,导致酶活力下降50%的抑制剂浓度(IC50)为0.094 mg/mL.抑制作用动力学研究结果表明,磺胺甲噁唑对酶的抑制作用为混合型可逆抑制,其抑制常数KI为5.98 mg/mL,对酶-底物络合物的抑制常数KIS为13.08 mg/mL.该研究对凡纳滨对虾的人工养殖具有一定的参考价值.