一例PPRV阳性羊鼻拭子样本N、P、M、F、H基因的序列测定和遗传进化分析

为对采集自昆明某大型牲畜交易市场的一例PPRV阳性鼻拭子样本进行追根溯源,设计引物采用RT-PCR方法进行PPRV病毒基因组关键基因N、P、M、F、H核苷酸序列扩增,并进行序列测定和遗传进化分析。结果显示:N、P、M、F、H基因均有预期片段扩增,其读码框(ORF)长度分别为1 578、1 531、1 008、1 641及1 830 nt;N、P、M、F及H构建的遗传进化树均显示所测毒株为基因Ⅳ型,同2013年在新疆伊犁山羊中检测到的毒株(KM091959)同源性最高,N、P、M、F、H核苷酸同源性分别为99.2%、99.0%、99.4%、99.6%和99.3%,推断氨基酸同源性分别为98.7%、98.4%、100.0%、99.8%和99.3%。研究表明,检测到的毒株仍为2013~2014年我国PPRV流行期的基因Ⅳ型毒株,变异较小;所测毒株的N、P、M、F、H 5个关键基因中,M基因最保守、其次是F/H基因,而N、P基因略有变异。

G1-like与F/98-like进化谱系的P B2、M基因在H5N6亚型禽流感病毒重配中的竞争优势研究

为评价不同H9N2亚型病毒供体在H5N6亚型禽流感病毒(AIV)重配中的作用,本研究选取全套内部基因与S基因型H9N2 AIV高度同源的3株H5N6 AIV流行株MZ34、YB0597和JT131,利用反向遗传学技术在MZ34的8基因重组质粒基础上另外添加F/98-like来源的PB2和M质粒,即以MZ34(8)+F/98(PB2+M)的10质粒组合(Group 1)共转染细胞进行重组H5N6病毒的竞争性拯救;PCR扩增经3轮空斑纯化后PCR扩增拯救病毒的PB2和M基因并测序鉴定。同时,为排除来源于同一母本病毒的8质粒易于自我组合包装的可能干扰,又将MZ34的PB2和M质粒替换为YB0597或JT131来源的质粒,构成另外的2种10质粒组合Group 2:MZ34(6)+YB0597(PB2+M)+F/98(PB2+M)和Group 3:MZ34(6)+YB0597(PB2)+JT131(M)+F/98(PB2+M),经共染获得拯救病毒,对其PB2和M基因PCR扩增后测序鉴定。结果显示,从Group1、Group 2和Group 3中拯救获得的重组H5N6病毒中PB2基因的构成情况S∶H分别为41∶23、48∶15以及37∶19,M基因的构成情况S∶H分别为40∶24、31∶32以及25∶31,而PB2和M基因的组合情况SS∶SH∶HS∶HH分别为27∶14∶13∶10、26∶22∶5∶10以及17∶20∶8∶11。表明相较于H型的F/98-like PB2与M基因,S型的G1-like PB2基因在各10质粒转染组的拯救的H5N6病毒重配中具有更显著的竞争优势,而G1-like M基因仅在Group 1组拯救的重组病毒中表现出优势,但G1-like PB2与M基因间的竞争优势叠加效应不明显。本研究为解析S基因型H9N2 AIV作为H7N9、H10N8等新型重组流感病毒内部基因供体的相关机制提供重要参考。

小反刍兽疫病毒的N、M、F及H基因的序列测定和分析

小反刍兽疫病毒属于副黏病毒科麻疹病毒属,为有囊膜的单股负链RNA病毒。以灭活的检测用抗原为材料,抽提基因组RNA作为模板,根据GenBank下载的序列及进行原核表达载体的要求,设计可扩增小反刍兽疫病毒N、M、F及H4个基因的全长读码框(ORF)的引物,进行RT-PCR扩增及扩增片段的T载体克隆、序列分析。结果显示,均有预期大小的片段扩增出。扩增片段经核苷酸序列测定、分析,N、M、F及H基因ORF全长分别为1578、1008、1641、1830nt;4个基因均与疫苗株Nigeria75/1(X74443)有100%的同源性,说明所购试剂盒用的检测抗原应该是用此疫苗株制备,也证明了设计用于原核表达的4对引物扩增片段的正确性。

H1N2亚型猪流感病毒HA、NP、NA、M和NS基因的克隆与序列分析

对3株H1N2亚型猪流感病毒（SIV）：Sw／GX／17／05、Sw／HN／I／05和Sw／GX／13／06的血凝素（HA）、核蛋白（NP）、神经氨酸酶（NA）、基质蛋白（M）和非结构蛋白（NS）基因进行克隆和序列分析。结果显示：3株分离毒株HA、NP、NA、M和NS基因之间核苷酸同源性分别为91．3％～98．0％、98．4％～98．8％、97．4％～98．3％、98．8％～99．8％和98．1％～98．4％。遗传进化分析显示：分离毒株与美国分离的三源基因重排HIN2sIV具有较近的亲缘关系；在HA、NP、M和NS基因进化树中，3株分离毒株均位于古典H1N1亚型SIV群，在NA基因进化树中，3株分离毒株则位于人流感病毒群。HA和NA基因推导氨基酸序列分别与代表毒株古典H1N1SIVA／swine／Maryland／23239／1991（H1N1）和人H3N2流感病毒A／BuenosAires／4459／96（H3N2）比较分析显示：HA（95．4％～96．1％）和NA（96．6％～97．2％）具有较高的氨基酸同源性；糖基化位点、抗原位点和受体结合位点（HA）处氨基酸存在一定的差异，这些氨基酸差异对病毒生物学特性的影响有待于进一步研究。

H1N1猪流感病毒介导小鼠 mmu-miR-206-3p下调及其对FN1表达过程的影响

为了分析H1N1猪流感病毒(SIV)介导小鼠mmu-miRNA-206-3p(mmu-miR-206-3p)下调及其对纤连蛋白1(FN1)表达过程的影响,试验选用10只6周龄雌性SPF级Balb/c小鼠建立感染H1N1 SIV小鼠模型,并将小鼠分为对照组和攻毒组,对照组用无病毒的尿囊液滴鼻,攻毒组用病毒尿囊液滴鼻,观察并记录小鼠的表现,利用RT-qPCR、Western-blot方法检测mmu-miR-206-3p、FN1和纤连蛋白1基因(Fn1)的变化。结果表明:感染H1N1 SIV 48 h后,对照组小鼠无异常表现,攻毒组小鼠精神萎靡,扎堆,食欲减退,被毛逆立。与对照组相比,12 h后攻毒组mmu-miR-206-3p相对表达量下降, FN1相对表达量升高,Fn1相对表达量变化不显著。说明H1N1 SIV可抑制mmu-miR-206-3p表达,减少mmu-miR-206-3p对Fn1翻译的抑制,进而导致FN1的相对表达量升高。

犬瘟热病毒H、F、N基因试验免疫研究

以构建的真核表达载体pVAXLPH、pVAXLPF和pVAXLPN为基因疫苗，分组进行了免疫小鼠试验，对免疫鼠体内免疫应答水平进行了检测。结果显示：所构建的基因疫苗可以诱导小鼠产生特异性免疫应答反应，pVAXLPH＋pVAXLPF＋pVAXLPN3个基因混合免疫小鼠诱导产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答，免疫3次后血清中抗CDV ELISA抗体效价为0．332，而免疫前为0．158；抗CDV中和抗体效价为1：（4～16）；CD4^＋T／CD8^＋T比值为2．05±0．38，而对照组为1．99±0．56；免疫小鼠脾细胞对CDVLP及ConA刺激的增殖反应值分别为0．384和0．356。基因疫苗免疫犬试验中，进行了单用基因疫苗免疫和基因疫苗与CDV弱毒疫苗联合免疫效果的比较研究。结果显示，基因疫苗免疫3次后，血清中抗CDVELISA抗体效价为0．296，抗CDV中和抗体效价为1：（8～32）。基因疫苗免疫2次，再使用弱毒疫苗加强免疫1次，血清中抗CDVELISA抗体效价为0．433，抗CDV中和抗体效价为1：（16～64）。

犬瘟热病毒小熊猫株H、F和N基因的克隆及表达

根据G enB ank中发表的犬瘟热病毒(CDV)的核苷酸序列,设计并合成了扩增CDV H、F和N基因的3对引物,经RT-PCR分别扩增获得了CDV小熊猫株(LP株)H、F和N基因,并对H、F及N基因进行了克隆和序列测定。序列分析表明,CDV LP株属于强毒谱系,与CDV流行株的亲缘关系近,H基因含有较多潜在的糖基化位点,F和N基因相对比较保守。将CDV LP株H、F和N基因克隆入真核表达载体pVAX 1的CM V启动子下游,构建了CDV基因疫苗表达载体pVAXLPH、pVAXLPF、pVAXLPN,体外转染BHK-21细胞,用间接EL ISA方法检测到目的蛋白的表达。用构建的3个表达质粒免疫小鼠,从小鼠血清中检测到了抗CDV抗体,初步证实用CDVH、F和N基因作为核酸疫苗免疫动物,可以激活机体的免疫应答。

2009年山东H9N2亚型禽流感M基因的分子进化分析及对哺乳动物致病性的研究

根据GenBank公布的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)M基因序列设计引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增H9N2亚型禽流感病毒M基因,并与GenBank中AIVM基因序列进行了同源性比较和氨基酸编码分析,绘制了M基因的系统发育进化树。结果表明:这6株病毒的M基因的核苷酸同源性在95.9%～99.4%。M1蛋白的同源性在97.6%～99.6%。M2蛋白的同源性在95.1%～100%。进化分析这6株病毒都属于A/Quail/Hong-Kong/G1/97(G1)-like分支。这6株病毒的M2蛋白的第31位氨基酸存在S→N(AGT→AAT)的变异,都具有金刚烷胺的抗性。以106EID50的剂量,将H9N2病毒鼻腔感染BALB/c小鼠,结果表明H9N2亚型流感病毒可以对哺乳动物小鼠可使得体重下降,也可致死。上述结果对于揭示H9N2亚型禽流感流行规律和病毒的致病机理具有一定的意义。

H9N2亚型禽流感病毒M基因的克隆与序列分析

对分离自中国南方的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangxi/KMⅢ/99(H9N2)的M基因进行克隆和序列分析。序列分析表明,该M基因全长1 027 bp,包含2个读码框,可分别翻译出M1和M22种蛋白质。M1由252个氨基酸残基组成,M2由97个氨基酸残基组成。与不同毒株比较,结果显示,该M基因与A/Chicken/Guangxi/10/99(H9N2)同源性为100%,当A/Chicken/Guangxi/9/99(H9N2)同源性为99%,与A/Chicken/Guangdong/5/97(H9N2),A/Chicken/Guangdong/11/97(H9N2)等中国分离株同源性达98%。

浙江省湖州市A(H1N1)pdm09流感病毒耐药基因的变异分析

【目的】了解浙江省湖州市2023年A(H1N1) pdm09流感流行株耐药基因变异和遗传进化特征。【方法】收集2家流感监测医院的呼吸道标本进行A(H1N1) pdm09流感病毒核酸检测,阳性标本接种MDCK细胞进行流感病毒分离和测序。应用DNA Star 7.1软件和Mega4.0软件对神经氨酸酶(NA)基因酶活性位点和M2离子通道蛋白(M2蛋白)与耐药相关的氨基酸位点进行分析。【结果】分离株与疫苗株的NA基因核苷酸同源性范围为98.87%~99.22%,氨基酸同源性范围为98.94%~99.36%。M基因核苷酸同源性范围为99.07%~99.85%,氨基酸同源性范围为99.02%~99.94%,分离株和疫苗株同属于6B.1A.5a.2a进化分支。NA基因酶活性中心关键位点氨基酸仍高度保守,与NA抑制剂耐药相关的9个关键氨基酸位点无变异,但部分流行株非酶活性位点发生一些变异。分离株M2蛋白与耐药相关的5个氨基酸位点未发生替换,但第31位氨基酸由丝氨酸变为天冬酰胺。【结论】2023年湖州市A(H1N1) pdm09流行株与世界卫生组织(WHO)推荐的2023—2024年疫苗株有较高的同源性。所有流行株均对金刚烷胺类药物耐药。

H7N9病毒的M1基因序列分析及原核表达

目的 克隆H7N9禽流感病毒M1并在原核细胞中表达,为进一步研究其生物学特性、免疫学功能及血清学检测奠定基础。方法 用PCR方法从禽流感上海分离株A/Shanghai/4664T/2013（H7N9）c DNA扩增M1基因,并克隆到载体p MD18-T中。经测序证实后,用EcoRⅠ/NdeⅠ双酶切,亚克隆到原核表达载体p ET28a,并转化E.coli BL21（DE3）菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定及western blot检验。结果 （1）经PCR、测序和酶切鉴定,成功克隆了禽流感H7N9 M1基因;（2）经IPTG诱导的重组质粒p ET28a-M1表达出约为28 k Da的融合蛋白,与预期结果相符;（3）对H7N9型禽流感M1基因序列分析表明,与2013年暴发的H7N9型禽流感病毒M1基因核苷酸序列同源性在95.4%-100%,与2006-2011年间暴发的H7N9型流感病毒M1基因序列同源性在69.0%-89.6%,2013年感染人的H7N9型流感病毒与此前暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支。结论 成功克隆了禽流感H7N9病毒的M1基因,并在E.coli中得以表达。

特征p=2的Cartan型李代数H（n,m）的导子代数

In this paper,we determine the derivation algebra of non-restricted Lie algebra H(n,m) of Cartan type in characteristic p=2.The main reault is following;Der(Hn,m))=adH(n,m)(H^m(n,m+Fd).

2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白及核蛋白基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)基质蛋白(M)及核蛋白(NP)基因的进化规律。方法:从NCBI数据库下载147条甲型H1N1流感病毒M基因及NP基因序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件对M基因和NP基因序列进行比对,并用NJ法构建进化树,同时采用EpiInfo软件分析1918～2009年人H1N1病毒的M基因和NP基因序列进化距离的线性趋势。采用MEGA4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对。结果:不同地区的2009年新型甲型H1N1流感病毒M基因、NP基因同源性高,但与历史上流行的H1N1流感病毒M基因、NP基因差异较大,且M基因进化距离随分离年限变化的趋势性检验结果有统计学意义(Ptrend=0.001)。2009年新型甲型A/H1N1流感病毒M2蛋白与1918～2008年人A/H1N1病毒M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示在第11、43、54、57、77、78氨基酸位点发生了改变;与猪、禽A/H1N1的M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示仅在第43、77位氨基酸位点发生改变。结论:2009年新型甲型A/H1N1流感病毒NP基因片段较以往流行的人H1N1流感病毒NP基因发生了改变;M2蛋白位于胞外编码区的第11位氨基酸、位于TM结构域的第43位氨基酸突变可能导致了新型甲型A/H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药。

H9N2亚型禽流感病毒传播途径特性的比较及其表面基因序列分析

选择中国大陆最早分离的H9N2亚型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）A／Chicken／Guangdong／SS／94（H9N2）（缩写为SS株）和1998年大流行时期分离的H9N2亚型AIV A／Chicken／Shanghai／F／98（H9N2）（缩写为F株）为研究对象，对其在SPF鸡体内的复制能力和传播途径特性比较后发现，F株在4周龄SPF鸡气管中的复制能力高于SS株，F株可以经气溶腔传播途径传播。SS株不能经气溶腔传播途径传播；利用反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法获取F株和SS株的HA和NA基因的cDNA，序列分析得知，F株和SS株的HA和NA基因的同源性分别是96．6％和98．1％；HA基因的裂解位点氨基酸序列都是PARSSR↓GL。但有5个氨基酸的盖异，即166位N（F）→D（SS）、198位A（F）→V（SS）、217位V（F）→I（SS）、335位G（F）→R（SS）、504位L（F）→S（SS）；2株病毒的NA基因在63～65住都存在氨基酸缺失，但在NA基因红细胞吸附位点的氨基酸序列不同，分别是IKKD—SRSG（F）和IKEDLRSG（SS）。F株和SS株的传播特性差异是否与其表面基因序列有关，有待进一步研究。

新城疫C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建

C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。从健康AA肉鸡肝脏中RT-PCR克隆C3d CDNA,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+)。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pCDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗。3周龄SPF鸡进行基因免疫,结果pCDNA-F-P29.4、pCDNA-F-P29.6较pCDNA-F都能够提高HI抗体水平及保护力,虽然HI抗体水平不及灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,并且pCDNA-F-P29.6效果更好。目前发表的关于C3d的佐剂作用的文章多是关于鼠C3d,相应的抗原不能够自然感染鼠类,关于鸡C3d的报道较少。研究结果为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。

H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

为建立检测禽流感病毒(AIV)且同时区分H3N2亚型AIV的方法,本研究根据H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因的保守区域,设计并筛选出3对特异性引物,通过优化反应条件,建立了AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR的检测方法。对该法进行特异性及敏感性检测,并通过该三重RT-PCR方法对96份临床样品进行检测。结果显示,H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带,其中518bp为AIV M基因、418bp为N2亚型AIV NA基因、271bp为H3亚型AIV HA基因;H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带,大小分别为518bp、271bp和518bp、418bp;其他亚型AIV可扩增出一条特异性条带,大小为518bp;常见禽病病原体均未扩增出任何条带。敏感性试验表明该法对H3N2亚型AIV的检测下限为100pg,96份临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究所建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR为一种简便、快速、有效的检测方法。

禽流感病毒H9N2亚型三重PCR检测方法的建立

为建立简便快速检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)并同时区分出H9、N2亚型的方法,本试验根据基因库中H9亚型AIV的HA基因、N2亚型AIV的NA基因及AIV的M基因序列,分别设计了3对针对这3种基因保守序列的引物,建立了AIV H9N2亚型的三重PCR检测方法。应用该方法对H9N2亚型AIV模板进行PCR扩增,可得到3条与试验设计相符的目的条带,分别为313bp(HA基因)、451bp(NA基因)和667bp(M基因);对非H9亚型的N2亚型AIV模板进行扩增,出现2条特异性扩增条带,即451bp(NA基因)和667bp(M基因);对非H9、N2亚型AIV模板进行扩增则只出现一条目的条带,即667bp(M基因);对其他禽呼吸道病原体进行PCR扩增,结果均为阴性。敏感性试验结果显示此三重PCR方法最低检出限为10-2 ng/μL。应用所建立的三重PCR方法对120份临床病料进行检测的结果与病毒分离鉴定结果一致。各项试验结果均表明,该方法对于禽流感病毒尤其是H9、N2亚型禽流感病毒的检测具有快捷、特异、灵敏的特点。

基于强跟踪GHF的里程计辅助SINS动基座对准研究

为提高车载捷联惯导系统动基座初始对准精度,提出了一种强跟踪降维高斯-厄米特非线性动基座初始对准算法。里程计辅助捷联惯导粗对准后水平姿态误差角为小角度,里程计辅助捷联惯导动基座对准模型简化为大方位失准角非线性模型,采用降维高斯-厄米特滤波(GHF),以少数非线性状态积分点估计整个系统状态,减少计算量,应用强跟踪滤波,提高系统对突变的滤波状态的跟踪能力。实验表明,应用强跟踪降维高斯-厄米特滤波提高了动基座初始对准精度,减少了计算量,提高了滤波的稳定性。

H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术的建立与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,参考Gen Bank登录的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA、M基因序列,利用Primer Premier5.0软件设计3对可扩增HA、NA、M基因的特异性引物以及反转录引物。3对引物扩增的c DNA片段大小分别为1 742、1 410、1 027 bp。结果:通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,与目的片段大小相符的片段,经测序均正确,且与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对HA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对NA基因的最低检出量为10-2μg/μL c DNA,对M基因的最低检出量为10-3μg/μL c DNA。通过对30份H9N2阳性病毒液进行三重PCR,均可同时扩出HA、NA、M基因。结果表明,本试验建立了H9N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR诊断技术,为提高H9N2亚型禽流感病毒HA、NA、M基因序列分析的效率奠定基础。

多重荧光定量RT-PCR检测高致病性H5N6禽流感病毒

目的建立一种快速检测流感病毒A型(FluA)及高致病性禽流感(HPAI)H5N6病毒感染的荧光定量RT-PCR法。方法以人细胞核糖核酸酶P(RP)基因作为临床样本的内参基因,用Primer Express 3.0软件设计PCR特异性引物和探针,建立一种检测FluA及HPAI-H5N6病毒的一步法多重荧光定量RT-PCR方法,评估其灵敏度、特异性,并与上海之江公司提供的试剂及测序法进行比较。结果建立的多重荧光定量RT-PCR法检测FluA、H5、N6及RP质粒标准品的灵敏度均达102copies/m L。各对引物和相应探针仅检测出相应的病毒,在这些病毒和常见病原分析中未发现存在交叉反应,特异性达100%。用该法检测135例临床标本,结果显示FluA为23例,未发现HPAI-H5N6病毒的感染者;与上海之江公司提供的试剂的检测结果及基因测序结果一致。结论建立的一步法多重荧光定量RT-PCR法可用于FluA及HPAI-H5N6病毒感染患者的早期诊断。