多肽N端修饰方法研究进展

多肽是源于生物体内的一类重要的生物活性物质,但由于稳定性差等原因,大大限制了其应用。通过对多肽进行结构修饰,可以改变其理化性质,进而提高其稳定性及生物活性。综述了近年来多肽N端修饰方法的研究进展,包括乙酰化、PEG(聚乙二醇)修饰、荧光试剂修饰、多肽N端亲水性基团修饰、NCL及EPL连接反应等,介绍了2-氨基辛酸、丁烯酶1、N-脒基-焦谷氨酰苯丙氨酸、N-terminal caps等多肽N端修饰实例。

GLP-1的N端修饰研究进展及其用于治疗Ⅱ型糖尿病的应用前景（英文）

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种人体内源性的肠促胰素,具有极强的体内降血糖活性,但在血浆中易被二肽基肽酶IV(DPP-IV)迅速降解失活,由于DPP-IV的酶切位点靠近GLP-1的N端,因此对N端进行结构修饰,可以延长GLP-1的体内降血糖活性。过去有关GLP-1的N端修饰研究中,主要包括对His7、Ala8和Glu9的结构修饰以及一些其他的结构改造(包括GLP-1的缩短肽类似物、小分子受体激动剂等),以期望在增强对DPP-IV酶降解耐受能力的同时,保持较好的受体结合力与激动活性。至今为止,用甘氨酸(Gly)或者α-氨基异丁酸(Aib)取代GLP-1的N端Ala8修饰策略已被用于II型糖尿病药物(Exenatide、Semaglutide、Albiglutide、Taspoglutide等)的临床研究中。本文具体描述已经报道的各类GLP-1的N端修饰研究工作进展,并讨论其在II型糖尿病治疗药物研发中的应用前景。

高碘酸氧化-还原胺化法对尿酸酶的聚乙二醇化研究

采用高碘酸氧化-还原胺化法对尿酸酶的N端氨基进行聚乙二醇修饰研究。首先,以相对分子质量为20 k D的单甲氧基聚乙二醇氨基盐酸盐(m PEG20000-NH2·HCl)和N-叔丁氧羰基-L-丝氨酸(Boc-Ser-OH)为原料通过酰胺化反应制备聚乙二醇中间体,然后由三氟乙酸(TFA)作用脱去Boc基团获得目标产物Ser-m PEG20000,该化合物经高碘酸钠氧化生成具有较高活性的聚乙二醇醛类衍生物,经超滤处理后即可用于蛋白质N端氨基的定点修饰,并对其修饰尿酸酶的条件进行了优化。聚乙二醇中间体和目标产物的结构通过IR和1H NMR进行表征,目标产物的总收率达72.8%。对尿酸酶的初步修饰研究表明,化合物Ser-m PEG20000具有较好的修饰蛋白的能力,对尿酸酶的最佳修饰条件为:Ser-m PEG20000与尿酸酶物质的量比为2∶1,在溶液p H 5.0条件下,于25℃反应6 h。

在大肠杆菌中拓展合成途径合成异胡椒醇

天然异胡椒醇作为一种植物来源香料,具有很高的经济价值。目前国内外还未见利用大肠杆菌工程菌株转化生产异胡椒醇的报道。【目的】构建工程菌,采用生物合成方法获得天然香料异胡椒醇。【方法】对来自胡椒薄荷的细胞色素P450家族的柠檬烯-3-羟化酶(LIM3H)基因PM2进行改造,截短LIM3H的N端疏水区,分别添加17α短肽或2B1短肽增加其亲水性,采用CO差示光谱法检测LIM3H活性;将N端疏水区截短后的来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的NADPH-细胞色素P450还原酶基因(trATR)和修饰后LIM3H基因(Modi-LIM3H)融合后表达,最终以柠檬烯为底物进行全细胞转化。【结果】3种N端修饰LIM3H基因均检测到LIM3H表达和异胡椒醇生成,其中17α短肽修饰后的蛋白表达量最高,异胡椒醇产量达到1.94 mg/L。【结论】本研究在大肠杆菌中增加外源LIM3H与ATR,成功催化柠檬烯生成异胡椒醇,为天然异胡椒醇的生产提供了新的方法。

真菌细胞色素P450在大肠杆菌中的表达

【背景】真菌细胞色素P450蛋白在大肠杆菌中表达水平低甚至不表达,近期研究发现通过对该类蛋白氨基端(N端)氨基酸序列的修饰可优化其表达水平。【目的】在大肠杆菌系统中表达预测功能为P450酶的焦曲霉094102菌株的Au8002蛋白,为真菌P450蛋白在大肠杆菌表达系统中的N端氨基酸序列修饰策略提供有效依据。【方法】对野生型P450蛋白Au8002的氨基酸序列进行分析,对其N端序列进行了3种序列修饰,并在诱导蛋白表达时添加P450生物合成前体5-氨基乙酰丙酸(5-ALA),研究N端氨基酸序列修饰策略及前体添加对真菌P450在大肠杆菌中蛋白表达的影响。【结果】SDS-PAGE和Westernblot检测结果显示,对目的蛋白进行的3种氨基酸序列修饰均使Au8002蛋白获得了表达,前体5-ALA的添加提高了目的蛋白表达量。其中对目的蛋白进行N端全长截短时可部分增加其可溶性,同时也验证了其特征性的CO结合能力。【结论】对预测为P450酶的菌株094102蛋白Au8002氨基端(N端)氨基酸序列的修饰有效解决了其在大肠杆菌内不表达的难题,实现了其可溶性表达;另一方面P450生物合成前体5-ALA的添加也能有效提高该类蛋白的表达水平,上述策略对改善其它该类蛋白在大肠杆菌内的表达水平具有借鉴意义。