层理鞭枝藻pecF基因的N端缺失及其表达

采用PCR技术 ,以层理鞭枝藻DNA为模板 ,扩增藻红蓝蛋白重组酶F基因 (pecF)部分DNA片段 ,从而获得pecF的N端缺失突变 ,该片段 (pecFn)的大小为 4 86bp .把pecFn插入pBluscript的多克隆位点得重组质粒pBlu pecFn ,经DNA序列测定 ,与文献报道的pecF基因该部分序列一致 .表达载体pGEMD经PvuⅡ、XhoⅠ双酶切消化 ,与pecFn连接 ,酶切鉴定pecFn已正确插入到该表达载体中 .将表达质粒pGEMD pecFn转化E .coliBL2 1(DE3) ,细胞经IPTG诱导 ,获得了高效表达 ,表达蛋白质的分子量为 18kDa。

重组人N端缺失MBL的原核表达及其活性研究

目的原核表达具生物学活性的重组人N端缺失甘露聚糖结合凝集素(rhMBL△N)蛋白。方法应用PCR技术,从含中国人野生型MBL cDNA的质粒pGEM-MBL中扩增rhMBL△N基因片段,插入pET43.1a载体后,转化E.coliBL21(DE3)感受态菌诱导表达rhMBL△N蛋白。应用Ni2+-NTA琼脂糖柱纯化目的蛋白,以SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行鉴定。结果从pGEM-MBL中扩增到长约620bp的DNA片段,构建的重组表达载体经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后出现约7270bp和620bp的片段,测序结果与预期的完全一致。表达的重组蛋白纯化后,经SDS-PAGE鉴定为Mr97000的蛋白。ELISA证实,纯化蛋白能与抗重组人MBL抗体结合,具备配体结合活性并能与人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶1、2的N端片段结合。结论获得了可表达rhMBL△N的菌株和具活性的rhMBL△N蛋白,为进一步研究提供了条件。

应用巢式PCR法克隆N端部分缺失的IκBα基因

目的 克隆中国人N端部分缺失的IκBα基因 ,为进一步应用其进行抗肿瘤基因治疗研究打下基础。方法 从中国人外周血中分离单核细胞 ,采用多聚赖氨酸贴壁刺激 0 .5h后提取总RNA。应用逆转录PCR法 ,以自行设计的引物扩增全序IκBα基因 ,应用巢式PCR法扩增N端部分缺失的IκBα基因 ,用TA克隆技术将目的基因连接到pGEM T质粒载体中 ,进行测序并与已知IκBα序列进行同源性分析。结果 测序结果表明我们所克隆的目的基因 ,其基因序列与GenBank中人IκBα基因序列仅有 5个碱基不同但所编码氨基酸仅 1个发生改变。结论 已成功克隆了中国人N端部分缺失的IκBα基因 ,为进一步应用N端部分缺失的IκBα基因进行抗肿瘤基因治疗研究打下了基础。