群体感应分子3-氧代癸酰基高丝氨酸内酯(3-oxo-C10-HSL)抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应

目的探讨群体感应分子3-氧代癸酰基高丝氨酸内酯(3-oxo-C10-HSL)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的调控作用。方法RAW264.7巨噬细胞分为实验组、对照组与空白组。实验组用不同浓度的3-oxo-C10-HSL与LPS共处理,对照组加入DMSO与LPS,空白组加入DMSO与PBS。刺激12 h后,实时定量PCR检测细胞白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的mRNA表达,ELISA检测上清液IL-6、TNF-α水平。以25μmol/L 3-oxo-C10-HSL与100 ng/mL LPS共刺激细胞15、30、60 min,Western blot法检测核因子κBp65(NF-κBp65)的磷酸化情况。结果3-oxo-C10-HSL能剂量依赖性地降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞的IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1的mRNA水平以及IL-6、TNF-α蛋白水平。3-oxo-C10-HSL能抑制LPS诱导的NF-κBp65磷酸化。结论3-oxo-C10-HSL能通过抑制NF-κB信号通路活化减轻LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应。

3-O-C_(12)-HSL通过抑制lncRNA CD48-AS和CD48的表达而阻碍Mo-DCs成熟

目的筛选并阐明长链非编码RNA(lncRNA)CD48-AS与其反义互补分子CD48 m RNA在N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)阻碍人单核细胞诱导的树突状细胞(Mo-DCs)成熟过程中发挥作用的机制。方法从健康人外周血中分离Mo-DCs,将未成熟的Mo-DCs细胞分为阴性对照组(0.1%DMSO)、脂多糖(LPS)阳性对照组(100μg/L的LPS)和实验组(100μg/L LPS+40μmol/L 3-O-C_(12)-HSL)进行lncRNA芯片检测。筛选lncRNA表达谱中差异表达5倍以上的自然反义lncRNA进行聚类分析,从中筛选差异具有统计学意义的自然反义lncRNA CD48-AS。未成熟的Mo-DCs分为阴性对照组、LPS阳性对照组以及LPS+C5、C10、C25实验组(分别加入5、10、25μmol/L的3-O-C_(12)-HSL)。利用荧光定量PCR检测lncRNA CD48-AS和反义分子CD48 mRNA在实验体系中的表达水平;通过生物信息学分析lncRNA CD48-AS与CD48反义互补区及其蛋白编码功能;通过核糖核酸酶保护实验(RPA)验证lncRNA CD48-AS是否与CD48形成二聚体,从而通过影响靶CD48的表达来发挥调控作用。最后检测lncRNA CD48-AS在细胞内的定位。结果 3-O-C_(12)-HSL处理Mo-DCs后lncRNA表达谱出现了特异性改变。3-O-C_(12)-HSL可下调由LPS诱导的Mo-DCs中lncRNA CD48-AS及其反义靶分子CD48的表达。生物信息学分析lncRNA CD48-AS不具备蛋白编码功能,为非编码RNA;lncRNA CD48-AS与CD48形成RNA二聚体从而减少RNA酶对CD48 mRNA的降解,使得CD48 mRNA表达增加;lncRNA CD48-AS在Mo-DCs中主要定位在细胞核中,细胞质中表达量较少。结论 3-O-C_(12)-HSL可通过下调lncRNA CD48-AS,进而影响CD48的表达来阻碍Mo-DCs的成熟。

miR-155在3-oxo-C12-HSL阻碍人单核细胞源性树突状细胞成熟过程中的表达变化

目的探讨miR-155在N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)阻碍人单核细胞源性树突状细胞(Mo-DCs)成熟过程中的表达变化。方法分离正常人外周血CD14+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人IL-4诱导分化为Mo-DCs。将不成熟Mo-DCs分为阴性对照组、模型组、实验组1、实验组2,阴性对照组加入同体积PBS,模型组加入终浓度为1μg/m L的LPS,实验组1和实验组2分别加入终浓度为1μg/m L的LPS后分别加入终浓度为50μmol/L和100μmol/L的3-oxo-C12-HSL,处理48 h。采用流式细胞术检测各组Mo-DCs表型(CD80、CD40、CD11c和HLA-DR),酶联免疫吸附法检测细胞培养上清细胞因子(IL-12、IL-10)水平,荧光定量PCR检测miR-155表达。结果与阴性对照组相比,模型组CD80、CD40、HLA-DR表达高,IL-10水平低,IL-12水平高,miR-155表达高(P均<0.05)。实验组1、实验组2与模型组相比,实验组2与实验组1相比,CD80、CD40、HLA-DR表达低,IL-10水平高,IL-12水平低,miR-155表达低(P均<0.05)。结论 miR-155在3-oxo-C12-HSL阻碍人Mo-DCs成熟过程中表达降低,3-oxo-C12-HSL可能通过降低miR-155表达阻碍Mo-DCs成熟。

群体感应分子3OC12HSL对猪回肠上皮细胞IPI-2I的影响

探讨群体感应分子3-氧代十二酰基高丝氨酸内酯(3OC12HSL)不同浓度和作用时间对猪回肠上皮细胞IPI-2I凋亡的影响及可能的作用机制。3OC12HSL浓度为0、50、100、200、400μmol/L,作用细胞时间分别为4、8、12、24 h。CCK-8法检测细胞活性,ELISA检测炎症因子水平,流式细胞仪检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测凋亡相关基因的mRNA表达水平。结果显示,200μmol/L 3OC12HSL作用8 h,显著抑制IPI-2I细胞活性,抑制效果呈时间和浓度依赖性;200μmol/L 3OC12HSL极显著升高促炎因子IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的浓度(P<0.01);100μmol/L 3OC12HSL作用12 h时,IPI-2I细胞凋亡而极显著提高(P<0.01);作用12 h后,100μmol/L 3OC12HSL显著提高细胞凋亡关键基因Bax表达水平(P<0.05),极显著提高Fas、Caspase8、Caspase3表达水平(P<0.01),400μmol/L 3OC12HSL显著降低Bcl-2表达(P<0.05)。结果表明一定浓度的3OC12HSL可降低细胞活性,诱导细胞炎症,引起细胞凋亡,不利于生猪健康。

3-O-C12-HSL通过PPARγ拮抗树突状细胞表达RP11-367F23.2

目的 研究N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C 12 -HSL)是否抑制单核细胞来源树突状细胞(Mo-DCs)表达RP11-367F23.2,该抑制作用是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)介导。方法 采用密度梯度离心法分离单核细胞来源的Mo-DCs;将Mo-DCs细胞分为4组:脂多糖(LPS)组、3-O-C 12 -HSL组、GW9662组和PBS组,18 h后收集细胞;荧光定量PCR检测4组中RP11-367F23.2表达情况。结果 Mo- DCs经3-O-C 12 -HSL刺激后,RP11-367F23.2表达量降低,3-O-C 12 -HSL组和LPS组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05);Mo-DCs经GW9662处理后,细胞中的RP11-367F23.2表达量升高,3-O-C 12 -HSL组和GW9662组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05)。结论 3-O-C 12 -HSL通过PPARγ拮抗Mo-DCs表达RP11-367F23.2。

3-O-C_(12)-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化

目的:观察铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerltginosa,PA)分泌的信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-oxododecanoy1-L-homoserine lactone,3-O-C12-HSL)阻碍单核细胞来源的树突细胞(monocytes derived-dendritic cells,Mo-DCs)成熟过程中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)表达谱的变化情况。方法:采用免疫磁珠法分选人外周血CD14+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4诱导分化为Mo-DCs。不同因素处理Mo-DCs,实验组加入终浓度0.1μg/m L的LPS和终浓度为40μmol/L的3-O-C12-HSL,对照组加入相应体积的含0.1%DMSO的PBS,模型组加入终浓度0.1μg/m L的LPS。利用lnc RNA芯片技术检测对照组、模型组和实验组间lnc RNA表达谱的差异。对筛选数据进行分析处理,利用散点图分析2倍以上差异lnc RNA在各处理因素间的总体变异情况,利用聚类分析研究表达差异5倍以上lnc RNA的聚类情况。结果:与对照组和模型组相比较,实验组筛选出2倍以上表达差异的lnc RNA为1 386条,其中上调表达的548条,下调表达的838条。筛选出具有5倍以上表达差异的lnc RNA共153条,占2倍表达差异lnc RNA的11.04%,其中上调表达的22条,下调表达的131条。散点图发现2倍表达差异的lnc RNA总体分布呈集中趋势,存在特征性改变。聚类分析发现5倍表达差异的lnc RNA能根据处理因素进行有效的分层聚类。结合GO分析和m RNA通路分析,差异lnc RNA的相关基因可富集至PPAR信号通路、钙信号通路和NF-κB信号通路中。结论:3-O-C12-HSL作用于Mo-DCs后,lnc RNA表达谱发生了特征性变化,表达差异的lnc RNA可能参与了3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程。

铜绿假单胞菌信号分子3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD的结合特性研究

目的制备纯化的人过氧化物酶体增殖物激活受体-配体结合域(PPARγ-LBD)肽段并观察铜绿假单胞菌信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)与PPARγ-LBD的结合强度。方法采用分子对接的方式预测3-O-C_(12)-HSL与PPARγ的结合位点。合成PPARγ-LBD基因序列并插入pET28b质粒,鉴定后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组肽段,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析。表面等离子体共振技术检测3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD的结合动力学参数。结果分子对接结果显示3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD区的Tyr473和Tyr327形成氢键,3-O-C_(12)-HSL末端柔性碳链与PPARγ-LBD区的Met329、Leu330等残基形成疏水结合。制备获得人PPARγ-LBD肽段,经SDS-PAGE及Western blot检测在25~35 ku有一条蛋白的印迹,与PPARγ-LBD分子质量一致。3-O-C_(12)-HSL与PPARγ结合的亲和力常数为1.65×10^(-4) mol/L,结合速率常数为1.06×10^(2)/ms,解离速率常数为1.75×10^(-2)/s。结论3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD功能区结合能力强于PPARγ特异性拮抗剂GW9662,为制备针对3-O-C_(12)-HSL的特异性靶向药物提供了实验依据。

血清LncRNA-ENST00000420480在铜绿假单胞菌感染中诊断价值

目的探讨长链非编码RNAENST00000420480作为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染诊断标志物的临床价值。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,免疫磁珠分选人CD14+单核细胞、hIL?4和hGM?CSF诱导分化为单核细胞衍生树突细胞(monocytes derived dendritic cells,Mo?DCs),分PBS组、LPS组和LPS+3?O?C12?HSL组。实时荧光定量PCR检测lncRNA?ENST00000420480表达量。收集临床PA感染患者血清21例,体检表观健康人血清32例,提取血清RNA,逆转录获得cDNA,荧光定量PCR检测lncRNA?ENST00000420480表达量,受试者工作特征曲线评价血清中lncRNA?ENST00000420480对PA感染的诊断效能,计算约登指数(YI)明确PA感染诊断截点(cut?off)。结果与PBS组相比,LPS下调Mo?DCs中lncRNA?ENST00000420480表达水平。与LPS组相比,3?O?C12?HSL上调Mo?DCs中lncRNA?ENST00000420480表达水平。PA感染组血清中lncRNA?ENST00000420480相对表达量为(3.85±4.18),正常人组血清中lncRNA?ENST00000420480相对表达量为(1.30±1.06),差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线中AUC为0.708(P=0.01),YI为0.429,诊断截点值为4.13。结论lncRNA?ENST00000420480可作为PA感染的血清学标志物。

3-O-C_(12)-HSL通过PPARγ抑制Mo-DCs表达IL-6

目的研究铜绿假单胞菌分泌的N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone,3-O-C12-HSL)是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferater-activated receptorγ,PPARγ)调节单核细胞来源的树突细胞(monocytes derived-dendritic cells,Mo-DCs)表达白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)。方法 PPARγ配体筛选实验体外检测3-O-C12-HSL是否与PPARγ结合。免疫磁珠法分选人CD14+单核细胞,人白细胞介素4(human Interleukin 4,h IL-4)及人粒单核细胞集落刺激因子(human granulocyte monocyte colony stimulating factor,h GM-CSF)诱导分化为Mo-DCs,不同浓度的3-O-C12-HSL处理Mo-DCs;PPARγ拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后,3-O-C12-HSL处理Mo-DCs,电化学发光法检测Mo-DCs培养上清IL-6浓度。结果配体筛选实验显示3-O-C12-HSL>4.60μmol/L时可竞争性结合PPARγ配体结合区。3-O-C12-HSL下调脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的Mo-DCs表达IL-6水平(P<0.05),PPARγ特异性拮抗剂GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL介导的IL-6表达下调(P<0.05)。结论 3-O-C12-HSL可与PPARγ相结合,并通过PPARγ调节Mo-DCs分泌表达IL-6。

铜绿假单胞菌OdDHL免疫应答及其防控策略的研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)释放的小分子信号N-(3-氧代十二酰基)-高丝氨酸内酯[N-(3-oxododecanoyl)-l-homoserine lactone, OdDHL]能控制生物膜的形成和毒力因子等表达,加重宿主的感染并影响免疫反应。细菌使用小分子信号驱动细菌细胞之间的通讯,以应对周围微生物群落的细胞密度和物种组成的变化,这一过程被称为群体感应(quorum sensing, QS)。现就铜绿假单胞菌QS释放小分子信号OdDHL的合成与调节、介导的免疫应答和以OdDHL为靶点的感染防控策略作一概述。