N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达

目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌E.coliDH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),在得到的转化子E.coliBL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株E.coliBL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株E.coliDH5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。

N-乙酰神经氨酸醛缩酶的固定化及固定化酶性质研究

使用LX-1000HFA氨基树脂对N-乙酰神经氨酸醛缩酶(NAL)进行固定化,并对游离酶与固定化酶的酶学性质及稳定性进行了对比研究。结果显示,最佳固定化条件为载体投放量5.0 g,固定化时间12 h,缓冲液浓度1.0 mol/L,pH7.5,温度25℃。在此条件下制备的固定化NAL活力最高,比酶活可达200 U/g湿载体。与游离酶相比,最适反应温度提高了5℃,最适反应pH没有变化,温度和pH耐受性明显提升。同时固定化酶储存稳定性和操作稳定性也显著增强,在4℃条件下储存10 d后其酶活仅损失6%,重复使用10次后仍保持初始酶活的80%。因此,该固定化酶具有良好的温度稳定性、pH稳定性、储存稳定性和操作稳定性,为酶法工业化生产N-乙酰神经氨酸研究提供了理论依据。

痰热清联合N-乙酰半胱氨酸对老年AECOPD患者血清IL-33/sST2轴表达的影响

目的研究痰热清联合N-乙酰半胱氨酸对老年慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者血清白细胞介素-33(IL-33)/可溶性基质裂解素2(sST2)轴表达的影响。方法选取老年AECOPD患者122例,根据随机数字表法分为治疗组(61例)与对照组(61例)。治疗组加用痰热清联合N-乙酰半胱氨酸治疗,对照组仅予N-乙酰半胱氨酸治疗,两组均持续治疗7 d。比较两组患者治疗过程中不良反应发生情况,并比较两组治疗前后的肺功能指标、动脉血气指标、IL-33/sST2轴相关炎症细胞因子以及IL-33、sST2 mRNA和蛋白表达水平。结果治疗后,治疗组患者的IL-33、sST2 mRNA和蛋白均低于对照组,差异均有统计学意义(t分别=10.00、6.80、10.30、11.26,P均<0.05);治疗组患者治疗后的IL-4、IL-5、IL-10以及气道峰压(Ppeak)、呼气峰流速(PEF)、一秒用力呼气容积占用力肺活量(FEV1/FVC)水平均高于对照组,差异均有统计学意义(t分别=17.95、7.55、7.79、6.59、7.06、7.34,P均<0.05);治疗组患者治疗后的动脉二氧化碳分压(PaCO_(2))低于对照组,而血氧饱和度(SaO_(2))、动脉血氧分压(PaO_(2))高于对照组,差异均有统计学意义(t分别=-5.02、11.40、7.12,P均<0.05)。结论痰热清联合N-乙酰半胱氨酸可明显改善老年AECOPD患者临床症状,延缓肺功能下降,利于病患预后的优化,疗效明显,其机制可能与抑制IL-33/sST2轴的活化及相关炎症因子释放有关。

鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的从鱼腥藻7120(Anabaenasp.PCC 7120)中克隆N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶(N-acyl--Dglucosamine 2-epimerase,AGE)基因,并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR技术从鱼腥藻染色体组扩增AGE基因,通过基因工程方法构建表达质粒pLY-11,在大肠杆菌中表达,并利用Ni-NTA柱分离纯化。利用柱前衍生化的方法,通过HPLC检测表达产物转化N-乙酰-D-甘露糖胺(N-acyl-D-mannosamine,ManNAc)的活性,并联合N-乙酰神经氨酸裂合酶(N-acetylneuraminatelyases,NAL),进行双酶转化生成N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)实验。结果AGE基因在大肠杆菌中表达,可溶性产物蛋白占总可溶性蛋白质量的18%,经纯化后得到1.6 g.L-1产物蛋白。双酶转化实验中,转化终产物Neu5Ac质量浓度为14.8 g.L-1。结论鱼腥藻7120 AGE基因在大肠杆菌中的表达产物具有活性,为双酶转化制备Neu5Ac进行了初步的探索。

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆及表达

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径。根据集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并人工合成目的基因序列slr975-co。将该基因克隆到表达载体pET28a中,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-slr并实现了目的基因的诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白质的相对分子质量在43 000左右,与预期大小一致,纯化产物蛋白质质量浓度约为1.7 g/L。重组AGE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为6.0。AGE对GlcNAc、ManNAc的Km值分别为39.0、46.5 mmol/L。以分别表达AGE和N-乙酰神经氨酸裂合酶(NanA)的重组大肠杆菌作为催化剂,以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物,实现了N-乙酰-D-神经氨酸的全细胞催化合成。结果表明,对AGE密码子进行优化实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为全细胞催化法高效合成N-乙酰-D-神经氨酸奠定了坚实的基础。

基因筛选克隆表达原花青素降解酶及其酶解条件优化的初步研究

针对化学法制备低聚原花青素存在环保压力和副产物多等问题,研究了通过生物酶法降解高聚原花青素来制备低聚原花青素的方法。首先通过基因筛选方法筛选出SananA和EcnanA基因用于酶法降解高聚原花青素,将SananA和EcnanA基因连接在不同质粒载体表达蛋白的结果表明,SananA基因连接在pETDuet-1载体上时的蛋白表达效果较优。进而,利用纯化的SananA蛋白优化高聚原花青素降解条件,结果显示较优的酶解条件为温度50℃、pH=10、反应时间8 h,在此条件下原花青素单体积累量为35.67 mg/g,二聚体积累量为14.49 mg/g。

血清唾液酸丙酮酸氧化酶测定新法的研究及应用

目的探讨建立一种血清唾液酸测定的新方法以及临床应用。方法应用N-乙酰神经氨酸酶、丙酮酸氧化酶、抗坏血酸氧化酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶、过氧化物酶与色原系统3-甲基-N-乙基(β-羟乙基)苯胺、4-氨基安替比林进行血清唾液酸浓度的酶法测定。结果磷酸盐缓冲液最适浓度为50mmol/L、pH 7.2,最大吸收峰值为510nm,线性范围为0～4 500mg/L,显色稳定。精密度为批内(n=30)变异系数(CV)=1.90%～3.3%,批间(n=30)CV=1.98%～3.5%,回收率为95.2%～105.1%,平均回收率为99.6%。与酶偶联速率法比较,相关系数(r)=0.996,回归方程Y=1.028 X+0.40,两法高度相关,正常参考值范围50～90mg/L。结论该方法具有高度的特异性和准确性,操作简便、灵敏快速、标本用量少、结果稳定,适用于全自动、半自动生化分析仪,更适用于中小型医院,有较高的推广使用价值。

酶动力学法测定尿唾液酸临床诊断初探

唾液酸(Sialic Acid,SA)学名N-乙酰神经氨酸,是一族复合物的总称,包括蛋白结合唾液酸(PSA)、脂质结合唾液酸(LSA)和游离唾液酸(FSA).SA多以结合形式存在于糖蛋白、糖脂结构的末端.含有SA的糖蛋白、糖脂主要存在于动物细胞膜上,细胞表面的许多特征性表现如免疫反应、分化等都与SA有关.近年来SA含量与疾病的关系的研究几乎无所不在,特别是在肿瘤如肺癌、胃癌明显升高[1-2];对肝硬化的诊断及预后判断有着重要意义[3];SA升高也是心血管疾病的危险因素之一[4];在糖尿病、中枢神经系统及细菌感染其含量显著异常[5].本文利用酶法测定尿中的唾液酸,并初步探讨在糖尿病肾病、肾炎临床诊断中的应用.

4-(N-乙酰氨基)-3-(4-芳基噻唑-2-氨基)苯甲酸乙酯的合成与生物活性

以3-氨基-4-乙酰氨基苯甲酸乙酯为原料设计合成了18种4-(N-乙酰氨基)-3-(4-芳基噻唑-2-基)-苯甲酸乙酯新化合物.化合物结构经质谱,元素分析,1H NMR和13C NMR确证.生物活性实验结果表明,化合物3d,3h,3p(40μg/mL)对神经氨酸酶(NA)的抑制率分别为36.02%,33.40%,42.05%;化合物3g,3h(500mg/L)对纹枯病菌的抑制率为50%.

颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平变化及意义

目的探讨颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清半胱氨酸蛋白酶裂解细胞角蛋白-18(CCCK-18)、神经轴突向导因子-1(Netrin-1)、乙酰肝素酶(HPA)水平变化及意义。方法选取200例颅内动脉瘤破裂后蛛网膜下腔出血患者,根据患者血管内介入术后是否发生慢性脑积水分为发生组52例与未发生组148例。比较两组临床资料及血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平,Logistic回归分析颅内动脉瘤患者血管内介入术后慢性脑积水的影响因素,绘制受试者工作特征(ROC)曲线评价CCCK-18、Netrin-1、HPA对颅内动脉瘤患者血管内介入术后慢性脑积水的预测价值,比较不同血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平患者生存预后情况。结果发生组年龄、Hunthess分级及Fisher分级与未发生组比较差异有统计学意义(P均<0.05);发生组术后第1、3、7天血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平均高于对照组(P均<0.05);Logistic回归分析结果显示,CCCK-18、Netrin-1、HPA均为颅内动脉瘤患者血管内介入术后慢性脑积水发生的影响因素(P均<0.05);CCCK-18、Netrin-1、HPA联合预测颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水的AUC为0.927,较单一指标预测AUC大(P均<0.05);术后第3天CCCK-18、Netrin-1、HPA高水平患者30 d内病死率高于低水平患者(P均<0.05)。结论颅内动脉瘤血管内介入术后慢性脑积水患者血清CCCK-18、Netrin-1、HPA水平较高,联合检测有助于慢性脑积水预测及预后评估。

药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸的酶法合成

目的利用在大肠杆菌中高效重组表达的O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶A(OASS-A)合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸,并对合成产物进行纯度及结构鉴定。方法通过PCR扩增目的基因Cys K,并连接到pET-22b(+)载体上构建原核表达质粒,重组体转到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达,重组蛋白采用Ni2+-树脂柱亲和层析纯化,利用SDS-PAGE鉴定表达纯化蛋白,通过HPLC对合成产物纯度进行检测,应用1H NMR技术对化合物进行结构鉴定。结果成功构建了OASS-A原核表达载体,在IPTG诱导下获得了高效表达。重组酶高效合成非蛋白质氨基酸S-苯基-L-半胱氨酸。合成的化合物以晶体形式析出,采用HPLC和1HNMR技术对其结构进行了鉴定,合成产物的纯度为100%。结论利用大肠杆菌中重组表达的OASS-A能够高效合成药物中间体S-苯基-L-半胱氨酸。

胸腹水样本的前处理在细胞涂片制作中的应用

目的探讨胸腹水样本的前处理对细胞涂片质量的影响。方法收集宁夏医科大学总医院病理科的胸腹水样本26例,其中16例血性胸腹水样本用红细胞裂解液处理红细胞,10例含黏液样物质的胸腹水样本用10%N-乙酰半胱氨酸溶液消化处理黏液样物质,用PBS处理作为对照。前处理组和对照组的样本分别制作细胞涂片,HE染色后在显微镜下进行观察。结果经红细胞裂解液处理的血性胸腹水涂片与对照组相比,红细胞背景明显减少。经10%N-乙酰半胱氨酸溶液处理后的含黏液样物质的胸腹水涂片与对照组相比,细胞团分布均匀,细胞未被黏液包裹重叠。结论红细胞裂解液处理后的血性胸腹水涂片和10%N-乙酰半胱氨酸溶液处理后的含黏液样物质的胸腹水涂片与对照组相比,涂片质量明显提高,更利于观察和诊断。

酶法检测唾液酸的性能验证及临床应用评估

目的 对酶法检测唾液酸（SA）的检测性能进行评价,并对SA的临床应用进行评估.方法 回顾性病例对照研究.检测150名表面健康人血清SA水平,建立参考区间;评估酶法检测SA的准确度、精密度、线性;对240例肿瘤患者按病理类型分组后,比较各肿瘤组血清SA浓度与健康对照组是否存在差异;对于存在差异的肿瘤,进一步收取疾病对照组,通过绘制ROC曲线,评价SA与其他肿瘤标志物的诊断性能.采用t检验、ANOVA方差分析、Mann-Whitney U检验进行统计学分析.结果 150名表面健康人血清SA水平为479～715 mg/L;2个水平质控检测结果为584、1 482 mg/L,均在厂商允许偏差范围之内,批内、批间变异系数（CV）＜5％,0～1 052 mg/L范围内线性良好（Y=0.995X-0.177,R2 =0.999）.胃癌组、对应良性疾病对照组、健康对照组的SA水平分别为（757±177）、（514±86）、（597±60）mg/L,差异有统计学意义（F =55.2,P＜0.01）.结直肠癌组、对应良性疾病对照组的SA水平分别为（659±127）、（545±66） mg/L,差异有统计学意义（F=42.8,P＜0.01）.肺癌组、对应良性疾病对照组的SA水平分别为（738±157）、（672±161） mg/L,其差异无统计学意义（F=26.3,P＞0.05）.SA在胃癌组中的曲线下面积（AUC）为0.804,结直肠癌组为0.724,肺癌组为0.755.在胃癌组中,SA的诊断敏感度为59.5％,优于CEA的24.3％;在CEA未增高的肿瘤患者中,SA在胃癌组中的AUC为0.791,结直肠癌组为0.687.结论 酶法SA检测性能符合要求.在胃癌组中SA的诊断性能优于传统标志物CA72-4和CEA,可以辅助CEA对部分肿瘤患者进行筛选和诊断.

硫素营养水平对大豆籽粒OAS-TL表达的影响

大豆氧乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OAS-TL)催化半胱氨酸合成,是硫素代谢的关键酶。试验以东农46(高油型)和黑农35(高蛋白型)为材料,检测鼓粒期后大豆籽粒OAS-TL在3个不同硫水平(0、0.02、0.08g·kg-1土)下的生理特性,鉴定克隆了该酶基因并分析了其调控表达情况。结果表明,①OAS-TL活性随生育进程推进持续下降,2个品种籽粒OAS-TL活性表现为S20高于S0和S80处理;鼓粒前期施硫效果大于后期;②通过同源克隆获得一个编码OAS-TL基因的cDNA序列,全长1059bp,ORF长855bp,编码34.2ku的蛋白质;③半定量RT-PCR显示OAS-TL稳定态mRNA在籽粒发育早期表达较强,且处理间差异明显,发育后期表达水平逐渐降低。不同硫素处理间OAS-TL的表达有差异,S20上调表达高于S0和S80。

鱼腥草对金黄色葡萄球菌生物被膜干预作用研究

研究鱼腥草水提物对金黄色葡萄球菌生物被膜的干预作用。采用微量肉汤稀释法测定鱼腥草水提物对金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的最低抑菌浓度;采用结晶紫染色法、扫描电镜及激光共聚焦显微镜评估鱼腥草水提物对CMCC(B)26003生物被膜形成的影响;最后采用实时荧光定量PCR方法测定鱼腥草水提物对O-乙酰丝氨酸硫化氢裂解酶B(O-acetylserine sulfhydrylase-B)cysM基因转录的影响。结果显示,鱼腥草水提物在12.500 mg/mL、6.250 mg/mL、3.125 mg/mL质量浓度下均可以有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,在12.500 mg/mL质量浓度下可下调cysM基因的表达。鱼腥草可能通过下调cysM基因的表达而抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。

多囊卵巢综合征大鼠氧化应激状态下血小板反应蛋白-1和三羧酸循环因子表达变化及意义

目的 观察来曲唑诱导的多囊卵巢综合征(PCOS)模型大鼠氧化应激状态下血小板反应蛋白-1(TSP-1)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、ATP柠檬酸裂解酶(ACLY)表达变化,探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对PCOS大鼠氧化应激的改善作用。方法 24只雌性SD大鼠随机分为PCOS组16只和对照组8只。对照组给予羧甲基纤维素钠溶液灌胃,PCOS组给予来曲唑+羧甲基纤维素钠溶液灌胃,均连续21 d。PCOS模型制备成功后,随机分为治疗组和模型组各8只。治疗组给予NAC溶液灌胃,模型组给予等剂量生理盐水灌胃,均连续28 d。第28天禁食,次日取腹主动脉血,采用ELISA法检测睾酮(T)、黄体生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)水平并计算LH/FSH,采用WST-1法检测超氧化物歧化酶(SOD)活力,采用TBA法测定丙二醛(MDA)含量;然后摘取大鼠双侧卵巢,观察卵巢外观及组织形态学改变,采用WST-1法检测SOD活力,采用TBA法检测MDA含量,采用Western blot法检测TSP-1、IDH1、ACLY蛋白相对表达量。结果 (1)模型组血清T[(118.49±67.98)ng/L]、LH[(18.76±11.32)u/mL]水平,LH/FSH(7.85±8.66)及MDA含量[(10.53±1.46)mmol/L]均高于对照组[(28.37±8.99)ng/L、(5.02±1.92)u/mL、0.69±0.55、(3.56±1.21)mmol/L]和治疗组[(60.03±19.64)ng/L、(8.82±1.83)u/mL、1.58±0.68、(6.50±1.02)mmol/L](P<0.05),血清FSH水平[(3.09±1.25)u/mL]及SOD活力[(81.50±10.20)u/mL]均低于对照组[(10.56±6.55)、(132.81±3.03)u/mL]和治疗组[(6.03±1.49)、(147.85±3.79)u/mL](P<0.05)。(2)模型组大鼠卵巢苍白,体积增大,表面可触及大小不均一的卵泡,镜下见卵巢未发育成熟的小卵泡以及部分闭锁卵泡、颗粒细胞层稀疏;治疗组卵巢体积缩小、颜色红润、表面平滑,镜下见呈囊状扩大的卵泡数量减少、颗粒细胞层增加。(3)模型组卵巢组织MDA含量[(20.24±3.10)nmol/mg port]高于对照组[(4.80±1.83)nmol/mg port]和治疗组[(12.20±1.89)nmol/mg port](P<0.05),SOD活力[(23.82±4.06)u/mg port]低于对照组[(39.35±3.03)u/mg port]和治疗组[(37.34±4.72)u/mg port](P<0.05)。(4)模型组卵巢组织TSP-1(0.38±0.09)、ACLY(0.56±0.16)、IDH1(0.45±0.09)蛋白相对表达量均低于对照组(0.97±0.15、1.32±0.32、1.03±0.19)和治疗组(0.68±0.07、1.06±0.21、0.72±0.11)(P<0.05)。结论 PCOS大鼠血清及卵巢组织氧化应激指标呈异常表达,NAC可减轻PCOS大鼠的氧化应激、改善PCOS表型;PCOS大鼠氧化应激下低TSP-1表达可能与三羧酸循环相关因子异常表达有关。

2013年“检验医学新技术”(国家级)继续教育试题答案

一、填空题（30分） 1．Micf；2．AcrAB—TolC；3．抑制；4．高；5．RNA聚合酶Ⅱ；6．游离态的唾液酸、聚唾液酸；7．N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）；8．负电荷性、体积大；9．小细胞肺癌；10．吸烟、大气污染；11．激光；12．透明质酸（HA）

应用酵母双杂交系统筛选与乙型流感病毒BM2相互作用的蛋白质

目的 筛选与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质。方法 应用酵母双杂交系统,以BM2 (2 6 10 9)插入载体pGBKT7作为诱铒,在四缺培养基上筛选人KidneyMATCHMAKERcDNA文库,寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白。结果 筛选得到6个阳性AD 文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD 文库质粒与BM2的相互作用。将阳性AD 文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是N 乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶,Angiopoietin 3、锌指蛋白2 5 1、核糖体蛋白S2 0、蛋白精氨酸N 甲基转移酶1(PRMT)、转录因子样1(TCFL1)。结论 BM2能与这些转录翻译功能相关的蛋白质相互作用,表明BM2蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。

获得性血栓性血小板减少性紫癜的诊治进展

血栓性血小板减少性紫癜(TTP)是一种血栓性微血管病,以微血管病性溶血性贫血(MAHA)和血小板严重消耗性减少为主要特征,伴或不伴神经系统损伤、肾功能损害和发热症状。TTP的发病率为3/百万~13/百万,多数为女性,获得性TTP发病率较高[1]。