小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用

目的 研究小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）的调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用.方法 通过对小肠结肠炎耶尔森菌3个AmpD蛋白同系物（AmpD1～3）基因（ampD1～3）、低分子量青霉素结合蛋白（LMM PBPs）基因（pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7）、NagZ基因（nagZ）以及ampR基因进行敲除或回补,以构建基因突变株,并利用头孢西丁对突变株进行诱导;采用检测头孢硝噻吩水解法测定诱导组和非诱导组突变株AmpCβ-内酰胺酶活性（单位为U）,采用luxCDABEreporter系统检测AmpCβ-内酰胺酶启动子活性[单位为相对光单位（RLU）],采用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定NagZ酶活性（单位nmol/L）.结果 AmpD1蛋白的功能较强,YEΔD1突变株的AmpCβ-内酰胺酶表达量出现上升,诱导组和非诱导组分别为（3.29±1.58）和（4.08±1.75）U.YEΔ5b、YEΔ4Δ5b、YEΔ5aΔ5b和YEΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性增强,其中YEΔ4Δ5b突变株活性最高,诱导组和非诱导组分别为（106903.16±61910.61）和（205427.45±45352.17）RLU.缺失3种基因的菌株中,YEΔ4Δ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（304108.04±99274.53）和（531440.21±68891.02）RLU;缺失4种基因的菌株中,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（1013810.99±260955.96）和（1230214.59±205526.79）RLU;敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3ΔZ突变株AmpCβ-内酰胺酶活性未发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株活性下降明显,诱导组和非诱导组分别为（0.30±0.20）和（0.29±0.21）U,基本降至野生株水平.结论 在肠杆菌科细菌中发现多个AmpD蛋白参与ampC基因的三级调控机制;发现以PBP5b为主,PBP4、PBP5a和PBP7共同参与的ampC基因调控模式;同时还证实了在小肠结肠炎耶尔森菌具有NagZ依赖和非依赖两种ampC基因调控途径.

基于拉曼光谱的大豆细菌性病害标志物研究

大豆在生长过程中因病害影响其产量会急剧下降,如果不及时判别出病害种类,喷洒相关农药,病害严重的大豆甚至会绝产。及时判别病害种类进行合理施药,阻止病害进一步发展是保证大豆安全生产的重要环节。目前,基于大豆植株细菌性病害的病原菌鉴定和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的鉴定方法,最短需要两天时间,因此,快速检测大豆病害种类的方法成为该作物,也是建立智慧农业生产的关键环节之一。应用拉曼光谱快速检测技术诊断大豆病害,构建N-乙酰胞壁酸分子空间结构,采用密度泛函理论通过利用B3LYP/6-31+(d,p)基组优化大豆细菌性病害标志物N-乙酰胞壁酸的分子结构计算其拉曼光谱,并进行理论因子校正,校正因子为0.9857;采用微区三级拉曼光谱技术探测该标志物N-乙酰胞壁酸的拉曼光谱,采用平滑、去基线、截取波数范围等过程进行光谱预处理;在理论和实验对比分析的基础上,指认大豆测试和计算的拉曼光谱对应的特征峰,峰值波数相差大多在0~10 cm^(-1),实验数据与理论计算结果基本一致,判定了振动拉曼光谱的特征峰及其对应的分子结构的关系。结果表明:大豆细菌性病害标志物N-乙酰胞壁酸分子在200~1650 cm^(-1)范围内含15个特征峰,较强峰值和振动归属分别为229.0 cm^(-1)的甲基摇摆振动和764.0 cm^(-1)环内的摇摆呼吸振动等,给出了键长、键角和二面角等15个振动峰的空间结构参数,指证了N-乙酰胞壁酸分子的特征结构。结果也证明了可通过多种生物分子的大豆拉曼光谱测量,筛选细菌性病害标志物N-乙酰胞壁酸分子的拉曼光谱,能够有效识别细菌性病害。智慧农业生产中利用拉曼光谱快速检测技术,是农作物病害检测诊断的一种有效方法,若结合应用机器学习方法与光谱分析识别,以快速、准确和便捷的方式为智慧农业的健康生产及保驾护航发挥效用,是推进我国农业发展的重要环节。

福赛斯坦纳菌体外培养实验技术的研究

目的探索福赛斯坦纳菌生长繁殖的基本条件,比较N-乙酰胞壁酸及不同营养因子对其生长繁殖的影响,筛选该菌体外培养的最佳营养条件,建立其体外培养的技术方法。方法 (1)培养基制备:在血平板中加0.005%N-乙酰胞壁酸形成改良培养基;制备血平板与不同浓度(0.5、3、10、50、100 mg/L)的N-乙酰胞壁酸形成的培养基;制备10 mg/L N-乙酰胞壁酸与氯化血红素、酵母提取物、维生素K3、脱纤维羊血组合形成不同组别的培养基。(2)接种培养后,用磷酸盐缓冲液将细菌洗脱,并用酶标仪(OD_(600))测定其吸光度。结果福赛斯坦纳菌在含N-乙酰胞壁酸的培养基中生长更好,浓度为10 mg/L时促进作用最明显且细菌形态更为典型。在组3培养基中生长最快。结论 N-乙酰胞壁酸能促进福赛斯坦纳菌的生长繁殖,浓度为10 mg/L时促进作用最明显;N-乙酰胞壁酸及氯化血红素、维生素K3、酵母提取物和脱纤维羊血组合能使其生长周期明显缩短。

PNAM氢解脱苄合成NAM的反应动力学

采用湿Pd(OH)2/C催化剂在排除扩散影响的条件下,研究了常压下N-乙酰保护胞壁酸(PNAM)在w(乙酸)=80%的溶剂中氢解脱苄合成N-乙酰胞壁酸(NAM)的反应动力学。通过空白实验消除湿Pd(OH)2/C及溶剂对吸氢量的影响,以吸氢量来表征反应程度。通过积分反应速率方程,对不同温度下该反应的实验数据进行了动力学计算。实验结果表明,在实验条件下,PNAM加氢脱苄反应合成NAM反应表现为一级,反应表观活化能Ea为76.496 kJ.mol-1,指前因子A为4.868×1010min-1。用IR、1HNMR、13CNMR、LC-MS和元素分析对产物进行了表征,证实了该化合物即是目标产物NAM。