小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用

目的 研究小肠结肠炎耶尔森菌β-N-乙酰葡萄糖胺酶（NagZ）的调控机制及AmpD蛋白对AmpCβ-内酰胺酶表达的作用.方法 通过对小肠结肠炎耶尔森菌3个AmpD蛋白同系物（AmpD1～3）基因（ampD1～3）、低分子量青霉素结合蛋白（LMM PBPs）基因（pbp4、pbp5a、pbp5b、pbp7）、NagZ基因（nagZ）以及ampR基因进行敲除或回补,以构建基因突变株,并利用头孢西丁对突变株进行诱导;采用检测头孢硝噻吩水解法测定诱导组和非诱导组突变株AmpCβ-内酰胺酶活性（单位为U）,采用luxCDABEreporter系统检测AmpCβ-内酰胺酶启动子活性[单位为相对光单位（RLU）],采用对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为显色底物测定NagZ酶活性（单位nmol/L）.结果 AmpD1蛋白的功能较强,YEΔD1突变株的AmpCβ-内酰胺酶表达量出现上升,诱导组和非诱导组分别为（3.29±1.58）和（4.08±1.75）U.YEΔ5b、YEΔ4Δ5b、YEΔ5aΔ5b和YEΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性增强,其中YEΔ4Δ5b突变株活性最高,诱导组和非诱导组分别为（106903.16±61910.61）和（205427.45±45352.17）RLU.缺失3种基因的菌株中,YEΔ4Δ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（304108.04±99274.53）和（531440.21±68891.02）RLU;缺失4种基因的菌株中,YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7突变株AmpCβ-内酰胺酶启动子活性最高,诱导组和非诱导组分别为（1013810.99±260955.96）和（1230214.59±205526.79）RLU;敲除nagZ基因后,YEΔD1D2D3ΔZ突变株AmpCβ-内酰胺酶活性未发生明显的变化,而YEΔ4Δ5aΔ5bΔ7ΔZ突变株活性下降明显,诱导组和非诱导组分别为（0.30±0.20）和（0.29±0.21）U,基本降至野生株水平.结论 在肠杆菌科细菌中发现多个AmpD蛋白参与ampC基因的三级调控机制;发现以PBP5b为主,PBP4、PBP5a和PBP7共同参与的ampC基因调控模式;同时还证实了在小肠结肠炎耶尔森菌具有NagZ依赖和非依赖两种ampC基因调控途径.

NAC抑制镉离子诱导的小鼠精子DLD酪氨酸磷酸化作用

重金属镉是环境中广泛存在的污染物,对机体生殖系统有很强的毒性作用。镉能诱导精子细胞蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶(DLD)发生酪氨酸磷酸化修饰,但机制尚不清楚。本研究利用蛋白免疫印迹技术探讨镉离子对小鼠生殖系统的毒性作用、镉诱导生殖细胞蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰的机理及抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)对精子的保护作用。结果表明,镉离子能减弱生殖细胞的能量代谢水平,从而抑制睾丸的生长发育并导致产仔数下降;镉离子能特异性诱导精子DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化修饰,且与钙离子具有协同作用。此外,NAC可在体外有效抑制DLD蛋白发生酪氨酸磷酸化从而抑制镉的生殖毒性,并恢复精子能量水平和活力参数。本研究从NAC抑制镉离子诱导特异性蛋白磷酸化修饰的角度,揭示NAC保护作用机制,旨在为镉离子生殖毒理学研究及疾病防治提供理论基础。

深海噬菌体BVE2内溶素的重组表达及其活性研究

本研究从一株来源于西南印度洋沉积物的噬菌体BVE2基因组中得到了一条全长702 bp,编码噬菌体内溶素的基因Lysin132,编码的蛋白共含有234个氨基酸残基,预计分子量为25.74 kDa;氨基酸序列同源比对结果表明BVE2 Lysin132具有多个酰胺酶活性位点。进化树分析结果表明BVE2 Lysin132是一种N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶。将Lysin132克隆到pEASY-Blunt E2 Expression Vector中,构建了E.coli-pEASY-Lysin132表达菌株。成功用IPTG诱导表达,得到了大量带有6×His标签的重组BVE2 Lysin132。经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳,得到单一目的蛋白条带。酶学性质分析结果表明,重组BVE2 Lysin132的最适反应温度为30℃,在中高温下热稳定性良好,在10~50℃下孵育90 min,仍能保持70%以上的酶活力;最适pH为7.0,在pH 6.0~8.0时均能保持80%以上的酶活力,表明该酶有较宽的pH作用范围;Na+、Mg^(2+)可以使酶活力显著提高20%以上,Ca^(2+)可以使酶活力提高40%以上。抑菌实验结果表明,重组BVE2 Lysin132对革兰氏阴性菌的抑制效果较好,尤其对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、坎氏弧菌(V.campbellii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)的抑制作用显著,与市售微生物溶菌酶相比,抑制效果最高提升了40%以上。因此,本研究获得了一种拥有较宽pH作用范围且热稳定性良好的内溶素,可为开发应用于水产养殖、食品保鲜、医药等领域的新型抑菌剂研发提供基础。

肺炎链球菌自溶素蛋白LytA对社区获得性肺炎的血清学诊断意义

目的通过原核表达技术获取肺炎链球菌（ATCC49619）自溶素LytA重组蛋白（rLytA），以此为抗原检测其抗体在健康人及社区获得性肺炎（CAP）患者外周血中的水平，为CAP的血清学诊断奠定基础。方法根据Genbank中公布的肺炎链球菌M66菌株LytA基因序列设计合成特异性引物。以ATCC49619株基因组DNA为模板，采用原核表达技术获取相对分子质量为56 000的重组蛋白rLytA。以rLytA为抗原，建立ELISA反应模式，测定健康人及CAP患者相应IgM抗体，并与痰培养结果比较。应用χ2检验评价结果差异。结果通过原核表达技术成功获得肺炎链球菌重组蛋白rLytA。以此为抗原，测得CAP患者血清中IgM类抗LytA的抗体滴度高于健康对照组，差异有统计学意义（P＝0.000），诊断的敏感度、特异度分别为27.8%和100.0%，痰培养的敏感度和特异度分别为19.4%和72.2%。血清学诊断的敏感度与痰培养相比差异无统计学意义（χ2＝0.693，P＝0.405），但特异度显著高于常规痰培养结果（χ2＝14.316，P＝0.000）。阳性预测值为100%，IgM类抗LytA抗体的阳性结果对肺炎链球菌的感染具有确诊价值。结论以重组蛋白LytA为抗原建立ELISA反应模式，检测IgM类LytA抗体，可能为链球菌感染性肺炎提供一条早期快速、客观诊断的途径。（中华检验医学杂志，2017, 40：212－215）