O连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰在神经退行性疾病中的研究进展

O连接N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化是一种由O-键连接的乙酰氨基葡萄糖和胞内蛋白上的丝氨酸/苏氨酸残基形成的蛋白质翻译后修饰。O-GlcNAc糖基化修饰在脑内普遍存在,其与转录、翻译和蛋白稳态等关系密切。O-GlcNAc糖基化修饰参与多种神经系统变性疾病的发生发展,但其调控机制尚不清楚。现就O-GlcNAc糖基化修饰与神经系统退行性病变的关系作一综述。

O连接N-乙酰葡萄糖胺糖基化在正常肝脏及肝脏疾病中的作用的研究进展

O连接N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化是将O-GlcNAc连接到靶蛋白的丝氨酸或苏氨酸位点上的一种蛋白质翻译后修饰,参与酶活性、蛋白稳定性、转录因子活性、蛋白质的亚细胞定位、分子之间相互作用等的调控。O-GlcNAc糖基化的异常与多种疾病相关,可能是一种全新的疾病治疗靶点。肝脏的生理稳态及各类疾病的发生、发展均与O-GlcNAc糖基化的失调密切相关。基于此,本文对O-GlcNAc糖基化在正常肝脏功能及非酒精性脂肪性肝病、肝细胞癌、肝损伤与再生中的作用的研究进展进行综述,旨在为肝脏疾病的治疗提供新思路。

N-乙酰葡萄糖胺二聚糖和三聚糖的制备

甲壳素细粉通过浓盐酸部分水解,活性炭吸附层析,以不同浓度的乙醇洗脱得三个组分。纸层析结果表明,这些组分分别为N-乙酰葡萄糖胺单糖、二聚糖和三聚糖。

烟酰胺和N-乙酰葡萄糖胺改善色斑效果观察

目的:比较含烟酰胺和N-乙酰葡萄糖胺的护肤品在改善色素沉着方面的效果。方法:双盲、基质对照人体试验。采用REAL3.0系统采集所有图像,用相关软件分析色斑面积百分比、L*a*b值、黑素相关的色斑面积百分比、平均黑素含量(灰度)和黑素相关的皮肤颜色均匀度;Chromameter测量非色斑部位皮肤颜色改变;由皮肤科专家分析使用护肤品前后照片改善情况和受试者自我比较进行主观评价。结果:与基质相比,含烟酰胺和N-乙酰葡萄糖胺的护肤品可以抑制色斑面积的增加,减轻紫外线引起的肤色加深和肤色不均匀。结论:正常人皮肤对含烟酰胺和N-乙酰葡萄糖胺的护肤品有良好的耐受性,与基质相比,该护肤品有一定的减轻色素沉着的效果。

由甲壳素制备N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的研究

虾壳经酸碱两次交替处理制得甲壳素.制得的甲壳素用浓盐酸部分水解得到N-乙酰葡萄糖胺低聚糖混合物,柱层析分离制备N-乙酰葡萄糖胺二聚糖(NAG).试验考查了水解温度、水解时间、盐酸浓度对水解反应的影响以及脱洗液浓度与二聚糖纯度的关系.甲壳素水解制备N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的适宜反应条件为水解温度50℃,水解时间5.5 h,盐酸浓度6.0 mol/L.分离N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的最佳脱洗液浓度为5%乙醇溶液,此条件下N-乙酰葡萄糖胺二聚糖的得率最高可达24.06%.

白念珠菌菌相转换基因HYR1上游N-乙酰葡萄糖胺激活序列的初步定位

目的:对白念珠菌菌相转换基因HYR1上游N-乙酰葡萄糖胺激活序列进行初步定位,探讨菌相转换可能的调控机制。方法:DNAssist 2.0软件分析HYR1基因上游1 800 bp内可能的N-乙酰葡萄糖胺激活序列片段,选择-1 800^+43bp、-1 400^+43 bp、-1 000^+43 bp、-600^+43 bp-、400^+43 bp-、200^+43 bp这些区域作为分析目标,PCR扩增这些片段,将其分别克隆至含β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因的载体PNG17中构建质粒重组体,分别命名pHYR1.8、pH-YR1.4、pHYR1.0p、HYR 0.6、pHYR0.4、pHYR0.2,测序确认后转化酵母菌EGY48,培养含有不同重组体的酵母转化子,将不同的酵母转化子接种于含有N-乙酰葡萄糖胺和β-半乳糖苷(X-gal)的培养基上,在不同条件下观察培养基的颜色变化。结果:成功构建6种重组体pHYR1.8、pHYR1.4、pHYR1.0、pHYR 0.6、pHYR0.4、pHYR0.2,经测序,插入片段与预期序列完全一致。酵母菌转化子生长良好,在N-乙酰葡萄糖胺作用下,含pHYR1.8和pHYR1.4的转化子使培养基成蓝色,含其他重组体pHYR1.0p、HYR 0.6、pHYR0.4、pHYR0.2的转化子不使培养基显色。结论:N-乙酰葡萄糖胺可能通过HYR1上游-1 400^-1 000 bp区域内的启动元件激活HYR1基因诱导白念珠菌菌相转换。

通过N-乙酰葡萄糖胺测定Sphingomonas sp.31555菌体量方法探讨

建立了一种新的方法测定威兰胶发酵液中的生物量,对该新方法进行初步条件优化以及干扰因子的排除,研究氨糖与菌体量的相关性。结果表明:随着发酵时间的增长,产胶量也会上升,而本方法应用于威兰胶发酵液中的生物量,并不受威兰胶及威兰胶水解产物的干扰影响。

N-乙酰葡萄糖胺糖基化修饰与糖尿病、阿尔茨海默病及心脏病的关系

蛋白质的O位N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)糖基化作为一种区别于一般糖基化的翻译后修饰,会使蛋白质的功能发生多种改变。近年的研究发现,蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰参与糖尿病、阿尔茨海默病与心脏病等多种疾病病理生理过程,因此对其研究具有积极意义。本文对蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰与糖尿病、阿尔茨海默病和心脏病发生的关系作一综述。

拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的原核表达及其多克隆抗体制备

目的:在大肠杆菌中分别重组表达拟南芥甘露糖苷酶Ⅰ(ATMDSI)和人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(HsGnTI),制备其多克隆抗体,为基因表达鉴定提供检测抗体。方法:用PCR方法克隆ATMDSI、HsGnTI基因片段,连接至pBV220表达载体后转化大肠杆菌DH5α,获得表达菌株,通过42℃升温诱导表达,制备纯化ATMDSI和HsGnTI;纯化的蛋白以80μg/kg的剂量免疫大耳白兔,经3次免疫后,采集血清制备其相应的多克隆抗体;采用Western印迹检测多克隆抗体的特异性。结果:获得ATMDSI和HsGnTI基因片段,并构建了其相应的原核表达载体pBV220-ATMDSI、pBV220-HsGnTI,在大肠杆菌中表达了重组ATMDSI和HsGnTI,SDS-PAGE分析显示其相对分子质量分别为45.3×103和46.9×103,与理论值一致;用纯化的蛋白免疫大耳白兔后制备了抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体,Western印迹结果证明该抗体具有较高的特异性。结论:获得了特异性较高的抗ATMDSI、HsGnTI多克隆抗体血清,为甘露糖苷酶Ⅰ和N-乙酰葡萄糖胺转移酶Ⅰ的研究提供了检测抗体。

麦胚凝集素化壳聚糖纳米粒及与N-乙酰葡萄糖胺的结合作用

凝集素(lectin)是非免疫源性的糖蛋白或糖特异体(sugar-specifity),19世纪由Stillmark发现,可选择性识别细胞膜表面糖分子或受体样结构,从而与糖基化生物膜结合(溶酶体传递方式的内化过程),充当给药系统的溶酶体样"佐剂"(drug delivery adjuvant)。

小地老虎β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因cDNA序列的克隆及mRNA组织特异性表达

β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆虫几丁质代谢中一种关键酶,在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。本文以小地老虎Agrotis ipsilon Hufngel预蛹期幼虫为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到其β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因的cDNA序列。该序列含有2701个碱基,包括一个1788个碱基的开放阅读框,编码一个含595个氨基酸的蛋白,分子量约为68.3ku,等电点为5.48。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶高度同源。基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU985280。该基因在小地老虎取食期和预蛹期的马氏管、中肠、脂肪体、体壁和去中肠虫体中均含有mRNA水平的表达。

蛋白质氧位N-乙酰葡萄糖胺修饰对脓毒症大鼠肾脏的保护作用

目的探讨应用谷氨酰胺（Gln）增加蛋白质氧位N-乙酰葡萄糖胺（O-linked N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰对脓毒症大鼠。肾脏保护中的作用。方法雄性SD大鼠，体重180g-240g，完全随机法分为5组：对照组（S组，行开关腹手术，n=12）；脓毒症组[C组，行盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）术，n=16]；Gln治疗组（G组，行CLP术，术后即刻Gln 0．75g／kg微量泵注1h，n=16）；槲皮素＋Gln干预组（Q组，行CLP术，术毕时腹腔注射槲皮素0．4g／kg，继予Gln微量泵注，n=16）；四氧嘧啶＋Gln干预组（A组，行CLP术，术毕时腹腔注射四氧嘧啶90mg／kg后，继予Gln微量泵注，n=16）。维持麻醉并记录CLP术后16h血压。24h测动脉血气分析，血浆肌酐（Cr）、尿液肾损伤分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）含量，肾组织匀浆热休克蛋白70（HSP70）、O-GlcNAc表达水平。结果CLP术后16h，C组平均动脉压（MAP）下降幅度超过基础值30％，G组、Q组、A组大鼠MAP下降明显，24h动脉血乳酸浓度c组、G组、Q组、A组较s组明显升高（P〈0．05）。CLP术后24h，C组血Cr为（57．4±4．9）mmol／L，尿KIM-1为（66．3±8．8）ng／L，较S组的血Cr（35．7±5．9）mmol／L、尿KIM-1（47．0±3．7）ng／L明显升高，G组血Cr为（42．2±5．4）mmol／L，尿KIM-1为（53．7±3．0）ng／L，较C组明显降低，Q、A两组血Cr分别为（51．4±2．9）、（57．4±2．6）mmol／L，尿KIM-1分别为（70．9±17．7）、（75．3±10．9）ng／L，较G组明显升高，差异均有统计学意义（P〈0．05）。肾组织蛋白质O-GlcNAc修饰水平G组较c组明显升高，A组较G组明显降低（P〈0．05）；肾组织HSP70表达C组较S组明显升高，G组较C组明显升高，Q、A组较G组明显下降（P〈0．05）。结论Gln通过增加细胞蛋白质O-GlcNAc修饰调节炎症反应，减轻脓毒症大鼠的肾损伤。

N-乙酰葡萄糖胺对人皮肤成纤维细胞透明质酸合成的影响

目的:研究外源性N-乙酰葡萄糖胺(NAG)对人皮肤成纤维细胞(HSF)透明质酸(HA)合成的影响,探索其作为护肤品成分的可能性。方法:分别用MTT、ELISA、改良Schales法检测不同NAG浓度下HSF的增殖、HA合成和分泌、对NAG的吸收率,RT-PCR测定NAG对HSF细胞透明质酸合成酶(HAS)3种同工酶HAS1、HAS2和HAS3 mRNA的影响。结果:MTT和改良Schales法结果显示,随NAG浓度升高,HSF细胞的增殖受抑制程度增加,对NAG的吸收率降低;ELISA结果表明,HSF细胞HA的合成对NAG呈剂量依赖性促进,5mmol/L浓度最佳;RT-PCR结果显示,HAS3 mRNA的表达在NAG浓度为3mmol/L和5mmol/L出现上调。结论:NAG可促进HSF细胞HA的合成和分泌,可能机制是NAG作为原料或者通过上调HAS3 mRNA表达水平来增加HAS活性从而提高HA的合成,提示NAG作为护肤品成分的可能。

基于Red同源重组技术构建N-乙酰葡萄糖胺发酵工程菌

N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是一种治疗骨关节炎、风湿性关节炎的有效药物。传统的GlcNAc生产方式费时费力且存在潜在过敏源,亟待开发低成本、环保高效的GlcNAc生产工艺。该研究首先利用Red同源重组技术将氨基葡萄糖合成酶(Glucosamine synthase,glmS)和氨基葡萄糖乙酰转移酶(Glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase 1,GNA1)整合至大肠杆菌基因组,构建GlcNAc诱导表达菌株。然后,进一步敲除man XYZ基因簇和nag DCABE基因簇,阻断GlcNAc胞内分解代谢途径。最后,考察副产物合成途径对GlcNAc产量的影响共构建了3株工程菌,分别为:单独敲除ldh A基因,阻断乳酸合成途径工程菌;单独敲除pta-ackA基因,阻断乙酸合成途径工程菌以及双基因敲除阻断乙酸、乳酸合成代谢途径工程菌。菌体生长曲线和GlcNAc发酵产量测定结果表明,单独敲除乙酸合成代谢途径工程菌生长速率减慢但GlcNAc产率最高,摇瓶发酵至72hGlcNAc产量达6 g/L。该研究利用Red同源重组技术构建GlcNAc合成途径、改造GlcNAc胞内分解代谢途径及副产物合成途径,成功构建GlcNAc发酵工程菌,为GlcNAc工业化发酵生产奠定了工作基础。

N-乙酰葡萄糖胺-6-转磺酶(CHST2)和岩藻糖基转移酶7(FucT-VII)在输卵管上皮的表达与输卵管妊娠的关系

目的:探讨输卵管上皮内N-乙酰葡萄糖胺-6-转磺酶(CHST2)和岩藻糖基转移酶7(Fuc T-VII)表达与输卵管妊娠发生的关系。方法:采用免疫组织化学和实时荧光定量PCR(RTPCR)的方法,检测输卵管妊娠患者的输卵管胚囊着床部位组织(EP-2组,n=23),输卵管胚囊着床旁部位组织(EP-1组,n=23),正常输卵管组织(CT组,n=16)的CHST2和Fuc T-VII的表达情况。结果:免疫组织化学法检测到输卵管妊娠胚囊着床部位CHST2和Fuc T-VII表达明显上调,与正常组相比差异有显著统计学意义(P<0.05)。RT-PCR方法检测CHST2 m RNA和Fuc T-VII m RNA在输卵管妊娠胚囊着床部表达水平高于正常组,差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:L-选择素与其配体相结合的机制可能参与了输卵管妊娠的发生。

鱼腥藻N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的从鱼腥藻7120(Anabaenasp.PCC 7120)中克隆N-乙酰-D-葡萄糖胺2-差向异构酶(N-acyl--Dglucosamine 2-epimerase,AGE)基因,并在大肠杆菌中表达。方法利用PCR技术从鱼腥藻染色体组扩增AGE基因,通过基因工程方法构建表达质粒pLY-11,在大肠杆菌中表达,并利用Ni-NTA柱分离纯化。利用柱前衍生化的方法,通过HPLC检测表达产物转化N-乙酰-D-甘露糖胺(N-acyl-D-mannosamine,ManNAc)的活性,并联合N-乙酰神经氨酸裂合酶(N-acetylneuraminatelyases,NAL),进行双酶转化生成N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)实验。结果AGE基因在大肠杆菌中表达,可溶性产物蛋白占总可溶性蛋白质量的18%,经纯化后得到1.6 g.L-1产物蛋白。双酶转化实验中,转化终产物Neu5Ac质量浓度为14.8 g.L-1。结论鱼腥藻7120 AGE基因在大肠杆菌中的表达产物具有活性,为双酶转化制备Neu5Ac进行了初步的探索。

离子对HPLC法测定N-乙酰-D-葡萄糖胺的含量

目的:建立离子对 HPLC 法测定 N-乙酰-D-葡萄糖胺及其制剂含量的方法。方法:采用 Alltima ODS 色谱柱(5μm,250 mm×4.6 mm);流动相为含10 mmol·L^(-1)四丁基硫酸氢铵的磷酸氢二钾(0.1 mol·L^(-1))溶液,用磷酸调 pH 至6.5±0.1;流速0.8 mL·min^(-1);柱温:室温;波长:220 nm。结果:在0.4～8μg的范围内 N-乙酰-D-葡萄糖胺峰面积与进样量呈良好的线性关系,r=0.9999;最低检出限为1.3 ng;最低定量限为4 ng;高、中、低3种浓度的回收率分别为99.9%,100.1%,100.2%;RSD 分别为0.46%,0.32%,0.28%。结论:该方法简单、灵敏、准确、专属性好。

N-乙酰-D-葡萄糖胺差向异构体及有关物质的HPLC研究

目的:对 N-乙酰-D-葡萄糖胺差向异构体和有关物质进行研究。方法:建立高效液相色谱法分离异构体及有关物质。色谱柱:Alltima C_(18)(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:水,流速:0.8 mL·min^(-1),检测波长:193 nm,进样:20 μL。HPLC/MS 研究有关物质归属,APCI 正离子模式。半制备-HPLC 法提取有关物质,色谱柱:Zorbax SB C_(18)(9.6 mm×250 mm,10μm),流动相:水,流速:3 mL·min^(-1),样品浓度:80 mg·mL^(-1),进样:100 μl。结果:N-乙酰-D-葡萄糖胺溶于水后自α型差向异构体向β型转化并最终达到平衡,初步研究表明本品固态为α构型;样品中有关物质为二乙酰基葡萄糖胺,水溶液中同样存在可互相转化的差向异构体。结论:用 HPLC 法可定量测定样品水溶液中平衡时α、β构型比例,并可检测样品有关物质的含量,为制定质量标准提供可靠依据。

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因的克隆及表达

N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(AGE)是合成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)的关键酶。该酶的高效表达是提高全细胞细胞催化法合成Neu5Ac的有效途径。根据集胞藻(Synechocystis sp. PCC 6803)AGE编码基因slr1975序列信息和大肠杆菌密码子偏好性,优化密码子并人工合成目的基因序列slr975-co。将该基因克隆到表达载体pET28a中,构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-slr并实现了目的基因的诱导表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白质的相对分子质量在43 000左右,与预期大小一致,纯化产物蛋白质质量浓度约为1.7 g/L。重组AGE的最适反应温度为42℃,最适反应pH为6.0。AGE对GlcNAc、ManNAc的Km值分别为39.0、46.5 mmol/L。以分别表达AGE和N-乙酰神经氨酸裂合酶(NanA)的重组大肠杆菌作为催化剂,以N-乙酰-D-葡萄糖胺为底物,实现了N-乙酰-D-神经氨酸的全细胞催化合成。结果表明,对AGE密码子进行优化实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达,为全细胞催化法高效合成N-乙酰-D-神经氨酸奠定了坚实的基础。

中国明对虾乙酰基专一性凝集素分离纯化方法的研究

为研究凝集素在中国明对虾天然免疫中的作用，利用3种不同物质——N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、胎球蛋白（Fetuin）和小牛黏液素（BSM）为配基，分别与3种柱材料结合进行亲和层析，从中国明对虾血淋巴中纯化凝集素。这3种亲和层析均得到了一种相同的凝集素FCL-1，经SDS-PAGE证明FCL-1的分子量为168kDa。利用新鲜小鼠血细胞进行分离纯化同样获得了这种凝集素。FCL-1与乙酰基糖类和唾液酸类糖蛋白均具有较强的结合特性。