信号分子N-乙酰高丝氨酸内酯(AHLs)诱导铜绿微囊藻细胞凋亡的研究

[目的]研究信号分子N-乙酰高丝氨酸内酯(AHLs)与铜绿微囊藻细胞凋亡的关系。[方法]以铜绿微囊藻为试验材料,采用5μmol/L AHLs处理铜绿微囊藻细胞,用DAPI染色后观察细胞凋亡的形态。[结果]AHLs在1μmol/L浓度下能诱导铜绿微囊藻的细胞凋亡,从而抑制铜绿微囊藻的生长和增殖。[结论]该研究结果为治理铜绿微囊藻水华爆发提供了科学依据。

N-乙酰高丝氨酸内酯酶对肉鸡生产性能的影响

为研究新型生物饲料添加剂群体感应N-乙酰基高丝氨酸内酯酶（淬灭素）对肉仔鸡生产性能的影响,采用单因素随机设计,选择健康、体重接近的肉仔鸡256只,随机分成2个处理,每个处理8个重复,每个重复16只,试验周期42 d10结果表明试验组肉鸡在1~21日龄饲喂淬灭素组肉仔鸡比对照组料肉比显著降低了0.05（P〈0.01）;试验组肉鸡在22~42日龄添加淬灭素组比对照组料肉比降低了0.04;试验组肉鸡1~42日龄肉鸡日增重比对照组平均值提高2.23 g,日增重提高3.37%（P〉0.05）,饲喂淬灭素组比对照组料肉比显著降低0.04（P〈0.05）,1~42日龄肉鸡试验组饲料转化率提高2.30%。试验结果表明,在本试验条件下在肉鸡饲料中添加500 g/t N-乙酰基高丝氨酸内酯酶可以提高肉仔鸡饲料转化率和日增重。

细菌语言分子——N-乙酰高丝氨酸内酯

近来的研究表明,在同种或异种细菌之间亦存在信息交流,人们把这种信息交流称为细菌语言(bacterial language)。细菌的语言是指发生在细菌个体(individual)之间的信息交流,而非个体内部的信号转导。细菌的语言不是通过"声波"之类的载体来实现,而是通过一些化学分子(chemical)来实现的。不同细菌使用的"语言分子"可有不同,N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine-lactone,AHL)是其中最常见的一种。随着对AHL的研究不断深入,人们发现它在细菌感染的早期诊断、早期治疗等方面有着极为广阔的应用前景。本文侧重介绍了AHL的结构特点、感应机制、抑制方法及其应用前景。

N-己酰高丝氨酸内酯对马铃薯生长及抗软腐病能力的影响

[目的]研究细菌个体间通讯信号N己-酰高丝氨酸内酯(C6-HSL)是否可以影响植物的生长和抗病能力。[方法]以马铃薯脱毒苗为试验材料,C6-HSL为诱导剂研究了经不同浓度C6-HSL处理后,马铃薯生长、抵抗胡萝卜软腐欧文氏菌浸染的情况,特别研究了C6-HSL对植株标志性防御酶活性和H2O2含量的影响。[结果]不同浓度的C6-HSL能明显抑制马铃薯的出根率和生根数,而对株高、茎节数及叶片大小没有影响;植物标志性防御酶类中POD和SOD的活性以及H2O2的产生量经C6-HSL诱导后显著提高,而PAL和PPO的活性则没有明显变化;抗病试验中,经C6-HSL诱导的马铃薯植株能有效抑制胡萝卜软腐欧文氏菌的侵染,发病率明显低于对照组。[结论]细菌AHL有可能成为一种新的植物抗病激活剂。

天然生物活性N-酰基高丝氨酸内酯小分子抗原的化学合成及其抗体生成初探

目的人工合成N-酰基高丝氨酸内酯(N-acylated homoserine lactones,N-aHSLs)完全抗原并制备相应单抗,建立N-aHSLs免疫检测的新方法及海洋弧菌N-aHSLs动态监测。方法以月桂酸和高丝氨酸内酯为主要原料,通过多步系列化学反应人工合成N-十二酰高丝氨酸内酯(N-lauroyl-homoserine lactone,N-C_(12)-HSL)及含羧基活性交联基团的半抗原衍生物12-羧基-N-十二酰高丝氨酸内酯(12-carboxyl-N-decanoyl-L-homoserine lactone,12-CD-LHL),用1H-磁共振、高压/效液相色谱仪和液相色谱-质谱联用方法确证合成产物的结构,并用生物感应法检测合成N-aHSLs的天然生物活性;用N-羟基琥珀酰亚胺活泼酯法将12-CD-LHL半抗原衍生物连接到载体蛋白;将N-C_(12)-HSL人工完全抗原通过传统单抗制备技术,获得抗N-aHSLs杂交瘤细胞株,用酶联免疫吸附测定法鉴定其特异性和效价。结果质谱、磁共振氢谱分析结果与理论预测相同,成功合成目标产物N-C_(12)-HSL和12-CD-LHL半抗原衍生物;所合成的N-aHSLs能够分别激活生物感应菌株大肠杆菌MG4和紫色色杆菌026并使之显色;紫外吸收光谱扫描结果显示,半抗原已分别与牛血清白蛋白和卵清蛋白发生偶联,成功制备完全抗原;共获得3株抗N-C_(12)-HSL单抗,均具有良好的免疫反应性。结论 N-aHSLs完全抗原和相应的单抗制备为N-aHSLs动态监测和后续研究奠定了基础。

一种新的乙酰高丝氨酸内酯水解酶基因的克隆和表达

目的获得新的降解革兰阴性细菌数量阈值感应信号分子乙酰高丝氨酸内酯类化合物(AHL)的水解酶基因。方法选择性富集和培养土壤中耐热细菌,抽取细菌总DNA作为模板,特异性聚合酶链反应扩增乙酰高丝氨酸内酯水解酶基因,进行克隆和DNA序列分析及原核表达。结果得到1个新的AHL水解酶基因,该基因与已知基因的核苷酸序列和对应的氨基酸序列同源性最高分别为87％和94％。该基因在原核表达系统中表达,得到了与预期相对分子质鲢(Mr)一致的蛋白质。结论证实乙酰高丝氨酸内酯水解酶广泛存在于环境微生物中。为进一步研究提供条件。

糖皮质激素联合N-乙酰半胱氨酸、大环内酯类治疗特发性肺纤维化

特发性肺间质纤维化（IPF）发病机制至今仍是一个谜，对于其治疗的研究各有优势。2015 ATS/ERS／JRS／ALAT发布的特发性肺纤维化（IPF）治疗指南强烈不推荐使用糖皮质激素治疗肺纤维化，但糖皮质激素作为经典控制炎症反应过程的药物，常常被用于特发性肺纤维化的治疗，特别是对于急性加重期特发性肺纤维化。而对于稳定期肺纤维化，并不推荐使用糖皮质激素。单独使用糖皮质激素、N-乙酰半胱氨酸、大环内酯类治疗IPF均不是指南推荐方案，且大量的传统研究均显示三种药物均不能够改善IPF的预后和病程。

罗红霉素联合N-乙酰半胱氨酸治疗稳定期的重度COPD

目的探讨罗红霉素联合N-乙酰半胱氨酸对稳定期的重度慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺功能、临床症状、氧化应激水平的影响。方法 60例重度慢性阻塞性肺疾病患者随机分为A、B、C、D四组,各15例。每组均给予舒利迭50/500μg,b.i.d.吸入治疗以及必要吸入万托林或可必特等作为基础治疗。A组给予安慰剂治疗,B组给予罗红霉素0.15 g,q.d.治疗,C组给予N-乙酰半胱氨酸600 mg,q.d.治疗,D组给予罗红霉素0.15 g,q.d.联合N-乙酰半胱氨酸600 mg,q.d.治疗。四组治疗时间均为12周。分别测定四组患者用药前后患者的肺功能、CAT评分、患者急性加重次数,血液中氧化应激指标(TGF-β1和γ-GCS),并比较。结果 B组治疗前后CAT评分、氧化应激指标TGF-β1、γ-GCS浓度略降低(均P<0.05);C组治疗后FEV1%增加,及CAT评分降低,氧化应激指标TGF-β1、γ-GCS浓度降低,优于治疗前及A组治疗后(均P<0.05);D组治疗后FEV1%增加,CAT评分降低,氧化应激指标TGF-β1、γ-GCS浓度降低,优于治疗前及治疗后A组(P<0.05)。结论罗红霉素联合N-乙酰半胱氨可能通过抑制氧化应激反应而改善患者肺功能及临床症状,减少急性加重。

细菌N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应系统检测

将群体感应中以N-酰基-高丝氨酸内酯为信号分子的紫色色杆菌(Chromobacte-rium violaceum)菌株作为实验材料,用滤纸片法、平板打孔法、平板点种法和平板划线法检测信号分子N-己酰-L-高丝氨酸内酯(C6-HSL)对紫色杆菌素合成的诱导作用,以及信号分子N-癸酰-L-高丝氨酸内酯(C10-HSL)的抑制作用,取得良好的实验效果.

Study on Induction of Microcystis aeruginosa Cell Apoptosis by Signal Molecule N-acetyl-homoserine Lactones(AHLs)

[Objective]The relationship between signal molecule N-acety-homoserine lactones（AHLs） and Microcystis aeruginosa cell apoptosis was studied.[Method]With M.aeruginosa as the test materials treated by 5 μmol/L N-acety-homoserine lactones（AHLs）,the morphology of cell apoptosis was observed through staining with DAPI.[Result]Microcystis aeruginosa cell apoptosis was induced by signal molecule N-acetyhomoserine lactones（AHLs） with the concentration of 1 μmol/L to inhibit the growth and proliferation of Microcystis aeruginosa.[Conclusion] The results provided the important scientific basis and new management ideas for the treatment of water bloom of Microcystis aeruginosa.

申氏杆菌37-1中群体感应淬灭内酯酶AiiS的功能分析

许多植物病原细菌通过群体感应(quorum sensing,QS)系统调控相关毒性因子的表达,而群体感应淬灭(quorum quenching,QQ)是通过干扰QS系统,达到防治植物细菌性病害的重要策略之一。本研究利用原位培养法分离得到2000多株不同菌株形态的植物根围细菌,结合QS系统信号分子检测平板筛选到7株具有QQ活性的候选细菌,其中菌株37-1可完全降解信号分子。16S rDNA序列分析表明,菌株37-1属于Shinella sp.。全基因组序列分析发现菌株37-1中存在一个可能的QQ降解酶编码基因aiiS(autoinducer inactivation gene from Shinella sp.)。系统发育分析表明AiiS属于α/β水解酶家族蛋白。液相色谱-串联质谱分析进一步表明AiiS可水解N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)类QS信号分子中的内酯健,生成酰基高丝氨酸,因此AiiS属于AHL内酯酶。将aiiS基因导入胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum Z3-3中,可显著降低该菌AHL信号分子和果胶酸盐裂解酶的产生及其在白菜、马铃薯和胡萝卜上的致病性。以上结果表明菌株37-1中AiiS蛋白是一种AHL内酯酶;病原细菌中异源表达aiiS基因可有效干扰相关病原细菌中QS系统的调控功能,表明AiiS蛋白具备开发为潜在新型生防制剂的价值。

小白菊内酯诱导耐药白血病细胞K562/ADR凋亡的研究

目的初步探讨小白菊内酯(PTL)对耐药白血病细胞K562/ADR细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法MTT法及LDH释放法检测小白菊内酯对K562和K562/ADR细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞内活性氧(ROS)的变化,Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9的表达变化。结果 PTL抑制K562/ADR细胞的增殖,呈剂量依赖,半数抑制浓度(IC50)值分别为(4.36±0.37)μmol.L-1、(10.6±2.81)μmol.L-1。10μmol.L-1PTL作用24 h诱导K562/ADR细胞的凋亡率为(31.21±0.40)%,其IC50值与凋亡率与K562细胞相比差异无显著性(P>0.05)。经10μmol.L-1PTL处理1 h,K562/ADR细胞内ROS增加;处理24 h,Bcl-2与Bax的比值降低、caspase-3、caspase-9酶源蛋白表达降低。用N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理细胞,能抑制细胞ROS水平升高和细胞凋亡。结论 PTL能诱导耐药白血病细胞凋亡,作用机制与其刺激细胞内ROS升高相关。

带cry3 Aa启动子的aiiA基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

N 乙酰高丝氨酸内酯 (N acyl homoserinelactones,AHLs) ,是一类数量感知 (Quorum sensing)系统中的信号分子 ,它参与诱导调控许多植物病原菌致病基因的表达。苏云金芽胞杆菌的AiiA蛋白能降解这类AHLs分子 ,进而可减弱病原菌致病基因表达产生的病害。苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因cry3Aa的启动子是一种不依赖芽胞形成的启动子 ,它相对于其它cry类基因的启动子有启动基因转录时间早 ,转录时间长的优点。通过重叠延伸PCR ,用杀虫晶体蛋白基因cry3Aa启动子替换编码AiiA蛋白的基因aiiA自身的启动子 ,构建了融合基因pro3A aiiA。将融合基因装入穿梭载体pHT3 0 4的BamHI SphI位点 ,得到重组质粒pBMB686并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株BMB686的AiiA蛋白表达量在各个生长时期均高于对照菌株 。

淬灭酶AiiO-AIO6酶学性质及对嗜水气单胞菌毒力因子的表达调控

将N-乙酰高丝氨酸内酯酶基因(aiiO-AIO6)插入表达载体pET28a构建了原核表达载体pET28a/aiiO-AIO6。转化大肠杆菌后筛选具有活性的重组子并对纯化的目的蛋白AiiO-AIO6的酶学性质进行了研究,同时研究了纯化的酶液对嗜水气单胞菌ATCC7966溶血素(Hemolysin,Hem)、细胞肠毒素(Cytotonic enterotoxin,Ast)、胞外蛋白酶(Extracellular protease,Ep)、丝氨酸蛋白酶(Serine protease,Sp)及磷脂酶Pho(Phospholipase A1,Pho)等5个毒力因子表达的影响。结果表明,pET28a/aiiO-AIO6在大肠杆菌中大量表达N-乙酰高丝氨酸内酯酶,纯化后的N-乙酰高丝氨酸内酯酶的最适作用条件为pH 8.0,30℃,在pH 6.0～11.0的范围内能够稳定的存在,在80℃条件下保温30 min后酶活力能够维持在65%以上;且该酶对多种金属离子、化合物和中性蛋白酶都具有很好的抗性;该酶对多种底物都具有一定的降解作用;以3-oxo-C8-HSL为底物时的Km值为0.015 mmol/L;比活力为583.33 U/mg。N-乙酰高丝氨酸内酯酶在培养8 h及12 h时对嗜水气单胞菌5个毒力因子的表达量都具有明显的下调趋势(P<0.05)。本实验通过测定AiiO-AIO6的酶学性质及证明AiiO-AIO6可以通过降解嗜水气单胞菌产生的信号分子来抑制其毒力因子的表达,从而为将其应用于水产环境及致病性嗜水气单胞菌的生物防治奠定理论基础。

AHL-QS减缓膜生物反应器膜污染研究进展

首先介绍N-乙酰高丝氨酸环内酯(N-acyl homoserine lactone,AHL)型生物群体感应(quorum sensing,QS)信号分子对膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)膜表面形成生物膜的调节机制,通过AHL-QS信号分子细胞间的交流,可决定生物膜形成及胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)分泌;系统阐述了应用AHL-QS信号分子降解酶及淬灭剂对MBR生物膜污染的控制效果,抑制或降解信号分子可显著降低生物膜形成能力,从根本上控制膜污染。此外,针对降解酶及淬灭剂新的固定化技术在MBR中的应用也作了介绍,如磁性载体、膜表面负载、微生物-管束及多孔微球包埋细胞技术。以AHL-QS为基础的膜污染控制策略对于MBR应用前景广阔,然而该技术的工程化研究仍有待进一步深入;加强AHL-QS信号分子识别及进一步明确QS系统对微生物代谢机制的影响是该领域未来重要的研究方向。

群体感应效应的抑制及在抗微生物感染中的应用

微生物间通过群体感应效应进行交流并调控重要基因的转录及表达。目前发现参与这种信息传递最普通的信号分子是N-脂酰高丝氨酸内酯。通过抑制N-脂酰高丝氨酸内酯在群体感应系统中的信号传导,可以阻断病原基因的转录启动,以抑制病原因子的表达和作用,达到抗微生物感染的目的,是一种潜在的防治疾病新途径。

C_6-HSL对蜂房哈夫尼菌生物学特性的影响

研究了蜂房哈夫尼菌野生株及Lux I基因缺失株(ΔLux I)所产生的群体感应信号分子对细菌生物学特性的影响。利用高效液相色谱法分析蜂房哈夫尼菌及ΔLux I不同时间所产生的C_6-HSL含量,并通过添加4、8、16、32μmol/L和64μmol/L的C_6-HSL来研究其对蜂房哈夫尼菌野生株及ΔLux I菌体生长、泳动性、生物膜形成的影响。蜂房哈夫尼菌野生株产生的C_6-HSL随培养时间的延长呈现先上升后下降的趋势,并在16 h达到最高浓度16.1μmol/L,ΔLux I不产生C_6-HSL。添加C_6-HSL并不会明显的改变蜂房哈夫尼菌野生株及ΔLux I的生长;但是会促进菌体的泳动能力;C_6-HSL会抑制蜂房哈夫尼菌野生株及ΔLux I生物膜的形成能力。

河蟹肝胰腺中4种脂类对细胞生长和亚细胞结构的影响

目的:研究河蟹肝胰腺中C-8神经酰胺-1-磷酸、N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯、磷酰胆碱和棕榈酰肉碱对细胞生长和亚细胞结构的影响.方法:利用细胞计数试剂盒和乳酸脱氢酶试验,检测不同质量浓度的4种脂类对斑马鱼胚胎成纤维细胞所表现的细胞增殖和细胞代谢的影响,并通过溶酶体和线粒体染色分析4种脂类对细胞溶酶体和线粒体形态结构的影响.结果:N-十二烷醇-L-高丝氨酸内酯表现为促进细胞增殖,并保持线粒体和溶酶体形态结构的完整;C-8神经酰胺-1-磷酸、磷酰胆碱、棕榈酰肉碱表现为抑制细胞增殖,并引起线粒体和溶酶体的结构发生不同程度的改变.结论:河蟹肝胰腺中的4种脂类物质不仅是食物的营养成分,还具有明显生物活性,能影响细胞代谢和亚细胞结构的完整性.

外源C12-HSL信号分子协同反硝化菌FX-4对活性污泥系统脱氮效果的影响

为探究外源信号分子的群体感应效应对反硝化菌FX-4及活性污泥系统脱氮的影响,将外源AHLs(酰基高丝氨酸内酯类)的C6-HSL和C12-HSL信号分子投加至反硝化复筛培养基中,探究AHLs对反硝化菌FX-4去除NO_(3)^(−)-N的影响。结果发现,外源投加C6-HSL和C12-HSL均可有效地提高反硝化菌FX-4的NO_(3)^(−)-N去除性能,增加反硝化菌FX-4的生物量,且C12-HSL协同反硝化菌FX-4的NO_(3)^(−)-N去除效果最佳;不同浓度的C12-HSL对反硝化菌FX-4的NO_(3)^(−)-N去除效果均有提升,且50 nmol·L^(-1)的C12-HSL可较大提升菌株FX-4的NO_(3)^(−)-N去除效果。将浓度为0、5 nmol·L^(-1)、50 nmol·L^(-1)、200 nmol·L^(-1)、500 nmol·L^(-1)和1000 nmol·L^(-1)的C12-HSL和反硝化菌FX-4同时投加至SBR活性污泥系统中,考察两者协同下系统脱氮性能、信号分子浓度和微生物群落结构的变化。结果表明,两者协同作用可对NO_(3)^(−)-N去除性能产生明显影响,投加信号分子的实验组R_(1)~R_(6)相对于空白对照组R_(0)的NO_(3)^(−)-N积累量减少20~50 mg·L-1,且C12-HSL投加量为100 nmol·L^(-1)的反应器R_(3)的NO_(3)^(−)-N消耗量最多,NO_(3)^(−)-N出水质量浓度较R_(0)降低约45 mg·L-1;此外C12-HSL信号分子对TN去除产生正影响显著,且C12-HSL投加量为100 nmol·L^(-1)的反应器能更有效地提升活性污泥系统TN去除效能。信号分子浓度变化检测结果显示,外源投加C12-HSL可以刺激系统其他AHLs分泌,特别是促进系统C4-HSL的分泌。微生物群落结构分析结果显示,外源投加反硝化菌FX-4和信号分子C12-HSL可显著影响活性污泥中微生物群落组成,加快活性污泥中微生物种群演替,使Thauera、Brevundimonas等脱氮相关菌属占比升高。以上结果可为信号分子作为应急手段强化活性污泥系统生物脱氮性能提供参考。

荧光假单胞菌2P24中PcoI-PcoR群体感应系统的自体反馈调控

荧光假单胞菌2P24的PcoI-PcoR群体感应(QS)系统信号合成基因pcoI的表达受多种因子的调控,其中GacS-GacA双因子调控系统在转录水平正调控信号合成基因pcoI的表达。为进一步研究QS系统调控因子,将2P24基因组文库转入gacA缺失的pcoI基因转录报告菌株PM203(pcoI-lacZ,gacA?),筛选可提高pcoI表达的基因。结果表明粘粒pP32-24可显著提高pcoI转录水平,亚克隆实验证明其中的功能基因为pcoI;外源添加标准信号分子3-氧-己酰高丝氨酸内酯(3-oxo-C8-HSL)同样可显著提高pcoI基因的表达,表明pcoI基因的表达对自身有正调控作用。同时构建了QS系统的另外一个组分pcoR基因的缺失突变体,pcoR基因缺失后pcoI的表达和N-乙酰高丝氨酸内酯信号分子(AHL)的产量明显低于野生菌株及其互补菌株,并显著降低该菌株的生物膜(Biofilm)形成能力。这些结果表明菌株2P24的PcoI-PcoRQS系统中,信号合成基因pcoI的表达受自体反馈调控,pcoR基因参与pcoI基因表达的调控以及生物膜的形成。