螺旋霉素生物合成基因簇中N,N-二甲基转移酶基因功能的鉴定

目的 确定螺旋霉素(SP)生物合成途径中编码两个N, N-二甲基转移酶的基因bsm9和bsm22的功能,并在基因阻断变株中分离纯化相应的SP前体物。方法 利用抗性基因插入或CRISPR-Cas基因编辑的方法阻断bsm9和bsm22基因,并对其进行基因回复实验。利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)联用分析变株Δbsm9和Δbsm22的发酵产物。利用半制备液相色谱的方法分离纯化缺少甲基化修饰的SP前体物,经核磁共振波谱(NMR)数据分析确定其化学结构。结果 成功构建了两个基因的阻断株Δbsm9和Δbsm22。Δbsm9变株的发酵液没有抗菌活性的物质产生,经HPLC-MS分析也未发现相应的SP前体物。而Δbsm22变株的发酵产物的抗菌活性下降50%以上,从Δbsm22变株发酵产物中分离出福洛胺糖缺少两个甲基的SP前体物。结论 bsm22基因负责SP生物合成中福洛胺糖上的N, N-二甲基的催化,而bsm9基因可能参与麦洛胺糖的N, N-二甲基化修饰,且两者在功能上不能互补。

合成茶树咖啡碱相关的N-甲基转移酶基因家族的克隆及序列分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能成分,它以黄苷为底物,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,通过N-甲基转移酶(NMT)类催化的一系列甲基化反应合成的产物。根据NMT基因高度相似的特性,利用长片段PCR法和侧翼序列克隆技术分离了白叶一号6种NMTs的基因组DNA全长,其中有2种为已报道的茶树咖啡碱合成酶基因TCS1、TCS2,1种为假基因,另3种基因分别被命名为TCS3、TCS4、TCS5,基因结构分析发现这6种基因均由4个外显子和3个内含子组成。山茶属植物的NMTs可聚为5类,其中TCS4和TCS5为与其他基因的相似性相对较低的一类。这些结果为今后更好地从基因组水平上剖析茶树咖啡碱的遗传机制提供有用参考。

二氢杨梅素通过抑制甲基转移酶诱导人乳腺癌MCF-7细胞PTEN基因去甲基化

目的观察二氢杨梅素对人乳腺癌MCF-7细胞中第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)甲基化及其表达的影响,并探讨相关作用机制。方法以CCK-8法检测细胞活力,qRT-PCR检测PTEN和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的mRNA表达,Western blot法检测PTEN的蛋白表达,荧光法检测细胞DNA甲基转移酶总活性,甲基化特异性PCR法(methylation-specific PCR,MSP)检测PTEN基因甲基化水平。结果细胞活力检测结果表明,二氢杨梅素可剂量依赖性降低乳腺癌MCF-7细胞活力(P<0.05);qRT-PCR和Western blot检测结果表明,二氢杨梅素可显著上调PTEN的表达(P<0.05),并呈现剂量-效应关系;MSP检测结果显示,二氢杨梅素可显著诱导MCF-7细胞PTEN基因去甲基化;qRT-PCR和荧光法检测结果显示,二氢杨梅素可显著降低MCF-7细胞DNMT1表达和DNMT活性(P<0.05)。结论二氢杨梅素显著诱导乳腺癌细胞PTEN基因去甲基化,促进其表达,其机制可能主要涉及对DNMT1表达和活性的抑制。

天然无咖啡碱茶叶N-甲基转移酶基因克隆与序列分析

本研究以天然无咖啡碱南昆山毛叶茶为主要研究材料,以不同咖啡碱含量的英红9号茶树品种和红山茶等山茶属植物为对照,采用RT-PCR技术,克隆获得南昆山毛叶茶、英红9号和福云6号茶树品种的NMT基因全长,分别编码365、369和369个氨基酸。序列比较分析表明南昆山毛叶茶NMT基因与其它茶树NMT基因的核苷酸序列同源性高于86.5%,氨基酸序列同源性高于86.3%,并包含了六个保守序列、三个SAM结合区A、B’、C及一个保守域VFFF。基于同源性比较,推测核苷酸序列的差异可能是导致南昆山毛叶茶NMT基因活性改变、影响茶树体内咖啡碱代谢的原因之一。

烟叶烟碱含量与腐胺N-甲基转移酶基因表达间的相关性

为探明烟碱合成与积累机制,采用大田试验方法,测定云烟87和红花大金元在四川省6个产区烤后烟叶的烟碱含量,检测其在旺长期、现蕾期及成熟期PMT基因的表达量,并分析PMT基因表达量与烟碱含量之间的相关性。结果表明:四川不同产区不同烤烟品种的烟碱含量差异较大,云烟87和红花大金元在古蔺烟区烟碱含量最高,分别为3.40%和4.37%;云烟87在米易烟区烟碱含量最低,为1.27%,红花大金元在会理烟区烟碱含量最低,为1.36%。经相关性分析,2个品种的烟碱含量均与成熟期PMT基因表达量呈极显著正相关,与现蕾期基因表达量呈显著(红花大金元)或极显著(云烟87)正相关。PMT基因表达量是影响烟碱含量的决定因素之一。

烟酰胺-N-甲基转移酶在癌症发生发展中的作用研究进展

烟酰胺-N-甲基转移酶(nicotinamide N-methyltransferase, NNMT)利用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,将烟酰胺转变为1-甲基烟酰胺。NNMT在肝脏组织、脂肪组织和某些癌组织中高表达,并在神经退行性疾病、肥胖和糖尿病患者的特定细胞中也呈现表达增加的趋势,因而国内外对NNMT的关注度上升。本文概述了NNMT在癌细胞迁移和侵袭、耐药性、凋亡、自噬等方面的作用,并对相关上下游的分子通路进行综述。

磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶基因G175A多态性与非酒精性脂肪肝的关系

目的研究磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶(PEMT)基因外显子8的G175A多态性与非酒精性脂肪肝(NAFLD)的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态法检测并比较51例NAFLD患者和50名健康对照者PEMT基因外显子8的G175A基因型、等位基因频率,分析不同基因型对各临床指标的影响。结果NAFLD组和正常对照组PEMT基因175位点的基因多态性分布差异有显著性(GG、GA、AA在两组中的比例分别是58.8%、78.0%和39.2%、22.0%和2.0%、0.0%,χ2=4.289,P=0.038),NAFLD组A等位基因频率高于对照组(21.6%比11.0%,χ2=4.127,P=0.042),NAFLD患者中G175A突变型的高密度脂蛋白水平低于野生型患者(2.88±1.02 vs 2.04±0.96,P<0.05),而低密度脂蛋白水平明显高于野生型(3.22±0.88 vs 3.87±0.35,P<0.01),Logistic回归分析显示基因位点pemtG175A突变型、低密度脂蛋白是脂肪肝形成的主要危险因素(P<0.05)。结论PEMT基因外显子8的G175A多态性与NAFLD发病易感性相关。

新疆结核病患者N-乙酰基转移酶2基因分型特征分析

目的研究新疆结核病患者N-乙酰基转移酶2基因(NAT2)多态性分布特点。方法纳入诊断为肺结核的132例患者为研究对象,应用多通道荧光定量分析仪测定NAT2基因多态性。所获取的数据采用χ^(2)检验,比较各组间基因型分布差异,以P<0.05为差异有统计学意义。结果132名患者中快乙酰化型患者为32人(24.2%),中间乙酰化型患者为66人(50%),慢乙酰化型患者为34人(25.8%),男性与女性患者间、老年与非老年患者间、北疆与南疆患者间乙酰化型的NAT2基因多态性存在一定差异,但均不具有统计学意义(P>0.05)。结论我区结核病患者NAT2基因多态性以中间乙酰化型为主,NAT2基因多态性在不同性别、年龄段及地区的结核患者中的分布无显著差异。

茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶(NMT)是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用PlantCARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767 bp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。

盐角草磷酸乙醇胺N-甲基转移酶基因(SePEAMT)启动子的克隆及瞬时表达

磷酸胆碱是合成磷脂酰胆碱和甘氨酸甜菜碱的重要前体,磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(PEAMT)是磷酸胆碱合成的关键酶。根据已知的SePEAMT cDNA5′端序列设计2个基因特异的反向引物(PP1,PP2),通过锚定PCR获得了PEAMT起始密码子上游1249bp的序列。RLM-RACE反应确定其转录起始位点A位于起始密码子上游301bp处,由此获得了948bp的SePEAMT启动子序列。PlantCARE和PLACE在线启动子预测工具分析表明:该序列除了含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box外,还含有一些胁迫诱导元件(如ABRE、HSE、LTR)和花粉特异的激活元件AGAAA。构建了SePEAMT启动子与报告基因GUS融合的表达载体pPro,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,染色结果表明SePEAMT启动子可以有效地驱动GUS基因的瞬时表达。

小鼠烟酰胺N-甲基转移酶基因的克隆及其表达

目的克隆和表达小鼠烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT)基因。方法设计特异引物,利用逆转录PCR克隆小鼠NNMT编码cDNA序列,并进行序列测定;然后通过PCR扩增,双酶切回收cDNA片段定向重组到载体pEGFP-N3中,采用PCR和酶切鉴定重组表达质粒;最后将其转染到真核细胞中,通过Western杂交检测其表达,用激光共聚焦显微镜检测其细胞分布。结果经RT-PCR获得了小鼠NNMT的编码cDNA序列,经测序证实克隆序列完全正确;PCR和酶切鉴定表明绿色荧光蛋白(GFP)标记的NNMT表达质粒pNNMT-GFP成功构建;转染至HEK293T细胞中,Western杂交检测到绿色荧光蛋白融合的NNMT特异表达,显微观察表明NNMT分布在细胞质中。结论成功构建了NNMT的表达质粒,并在小鼠中实现其表达。

蛋白精氨酸甲基转移酶5表达与非M3型急性髓系白血病疗效关系的临床观察

目的讨论蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)与急性髓系白血病(AML)患者低甲基化药物(HMA)治疗敏感性的关系。方法通过GEPIA和TCGA数据库分析AML患者PRMT5表达及其与AML患者生存的关系。收集2020年1月至2023年10月收治的81例AML患者,包括50例非M3型患者和31例M3型患者。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测骨髓样本中PRMT5表达。采用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)检测基因组甲基化水平。结果TCGA数据库中AML患者PRMT5表达显著高于健康对照人群(P<0.01);PRMT5高表达组患者总生存期更短(P=0.036)。进一步分析TCGA数据库,巩固期给予HMA后,PRMT5表达对无事件生存率(EFS)和OS的有明显影响(P<0.010)。81例新诊断AML患者PRMT5表达显著高于23例健康志愿者[3.25(1.69,5.16)vs.1.00(0.72,1.35),P<0.001]。非M3型AML患者PRMT5表达高于M3型患者[4.51(2.05,7.25)vs.2.01(1.53,3.35),(P<0.001)]。在非M3型AML患者中,PRMT5高表达与BM原始细胞百分率以及不良基因突变和高危患者比例更高有关(P<0.05)。与未接受HMA治疗患者比较,接受HMA治疗的PRMT5高表达非M3型AML患者CR率显著增加(P=0.003)。通过WGBS测序,PRMT5高表达组CpG岛甲基化比率以及转录起始位点、转录终止位点CpG岛甲基化比率高于PRMT5低表达组(P<0.001)。结论在非M3型AML患者中PRMT5高表达,PRMT5高表达预示着更多非M3型AML患者从HMA治疗中获益。PRMT5可能是评估肿瘤甲基化富集和预测疾病预后的潜在生物标志物。

棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

【目的】克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究。【方法】根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。采用半定量RT-PCR方法研究GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达。构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。【结果】从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,GhCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1101bp、1098bp、1071bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸。GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高。SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2mmol·L-1IPTG在37℃下诱导6h。【结论】从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。

龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因的克隆和表达分析

【目的】克隆龙眼咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(DLCCoAOMT)基因,分析其序列特征和在低温胁迫下不同组织中的表达情况并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从龙眼叶片中克隆DLCCoAOMT基因,用生物信息学方法对获得的氨基酸序列进行分析,利用荧光定量PCR研究DLCCoAOMT基因在不同组织中的表达。【结果】克隆得到DLCCoAOMT基因,GenBank登录号为JN093023。该cDNA全长993 bp,具有1个744 bp的完整开放阅读框(ORF),编码247个氨基酸。序列分析表明,DLCCoAOMT编码的氨基酸序列与其它植物的CCoAOMT蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,龙眼DLCCoAOMT与桦木属的CCoAOMT蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量技术进行组织表达模式分析发现,DLCCoAOMT基因在根、茎、叶中均有表达。总体上表达量在根和茎中较多,叶中较少,随着低温胁迫时间延长,DLCCoAOMT基因在各组织的表达量也发生变化。原核表达结果表明,DLCCoAOMT基因在大肠杆菌中获得表达。【结论】从龙眼中克隆到咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因,该基因可能参与调控低温胁迫。

丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因(SmCOMT1)的克隆及其分析

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-O-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的COMT基因,命名为SmCOMT1(GenBank注册号为JF693491)。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。SmCOMT1 gDNA序列长2 275 bp,包含4个外显子和3个内含子。序列分析结果表明,SmCOMT1编码的多肽具有COMT的序列保守元件,与同科植物罗勒COMT编码的多肽高度同源,同源性达到89%。系统进化树分析表明,SmCOMT1与双子叶植物的COMT亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SmCOMT1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其中茎中的表达量最高,并且其表达受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导,显示SmCOMT1基因可能在植物防御反应中发挥作用。

棉花咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶基因的克隆及表达

根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)基因EST序列设计引物,采用RT-PCR技术首次从棉花中克隆了一个CCoAOMT基因,命名为GhCCoAOMT1(GenBank登录号为FJ848871)。研究结果表明:GhCCoAOMT1基因cDNA全长960bp,具有一个753bp的开放阅读框,5′非编码区为9bp,3′非编码区为198bp,编码250个氨基酸,预测分子量约为28.306kDa,等电点为5.39。利用PCR方法克隆了GhCCoAOMT1基因的基因组序列,长度为1311bp,包含5个外显子和4个内含子。氨基酸同源性分析发现,GhCCoAOMT1与来自毛白杨、烟草和苎麻的CCoAOMT同源性较高。半定量RT-PCR检测表明,GhC-CoAOMT1基因在棉花各个组织中都有表达,其中茎部的表达量最高,其次表达量依次为根>花瓣>子叶>10d纤维>雄蕊>胚珠>叶。

结核病患者N-乙酰基转移酶2基因型与异烟肼血药浓度关系的研究

目的探讨结核病患者N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因型与异烟肼(INH)血药浓度的关联性,为临床根据NAT2基因分型指导合理INH用药提供依据。方法应用PCR结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对121例住院结核病患者NAT2基因型分布进行检测,同时应用液相色谱-串联质谱分析仪(LC/MS-MS)检测结核病患者服药2h后血浆INH浓度。所获数据采用单因素方差分析检测组间差异,进而采用Tamhane’s T2法进行两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果 121例结核病患者NAT2基因型中快速乙酰化型(RA,野生型)有55例,INH血药浓度为(1.86±1.28)μg/ml;慢乙酰化型(SA,纯合突变型)有17例,INH血药浓度为(5.86±2.10)μg/ml;中间乙酰化型(IA,杂合突变型)有49例,INH血药浓度(3.49±2.60)μg/ml。住院结核病患者整体INH血药浓度均值为(3.08±2.42)μg/ml。三型INH血药浓度比较,差异均具有显著统计学意义(RA与IA,P=0.001;RA与SA,P=0.002;IA与SA,P=0.000)。结论不同NAT2基因型人群对INH的代谢能力差异存在显著统计学意义,NAT2基因型分析对结核病患者INH用药具有重要指导意义。

咖啡碱合成N-甲基转移酶研究进展

咖啡碱是茶叶、咖啡等饮料的主要品质成分及功能成分之一。在植物体内咖啡碱生物合成的核心途径为:黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤核苷→7-甲基黄嘌呤→可可碱→咖啡碱,其中包括3步由N-甲基转移酶催化的转甲基化反应和1步由核糖核苷水解酶催化的脱核苷反应。N-甲基转移酶是参与咖啡碱生物合成的关键酶类。介绍了植物中咖啡碱的基本情况及其生物合成途径,重点综述了咖啡碱合成N-甲基转移酶的酶学特性、NMTs的克隆、基因结构与功能的关系以及基因表达调控研究等方面国内外的研究进展,并对未来该领域的研究重点进行了探讨和展望。

二脂酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)基因研究进展

二脂酰甘油酰基转移酶2(Acyl CoA:Diacylgycerol Acyltransferase 2,DGAT2)是生物体内的一种非常重要的酶,其主要机制是使二酰甘油加上脂肪酸酰基辅酶A以共价健结合形成三酰甘油。编码该酶的基因有DGAT2和DGAT1。文章综述了DGAT2基因的发现、定位、结构、生物学效应及其遗传多态性与生产性能的关系,并对其应用前景进行了展望。

急性白血病患者DNA甲基转移酶基因的表达其及临床意义

为了探讨DNA甲基转移酶(DNMT)基因在成人急性白血病(AL)患者中的表达及其与临床预后之间的 关系,对72例AL患者和20例正常人的骨髓采用RT-PCR方法进行DNMT、p15INK4B、mdrl mRNA水平的检测;对 56例AL患者和14例正常人p15INK4B基因启动子区域CpG岛甲基化率,采用甲基化特异性PCR方法进行检测。结 果表明:AL患者组所有3种DNMT表达均明显高于对照组(P<0.01),改用细胞增殖核抗原(PCNA)为内对照, 差别仍有统计学意义。AL患者3种DNMT基因表达之间呈明显正相关,表现为协同的高表达;p15INK4B、mdrl与 DNMT表达呈明显负相关。DNMT因同时阳性患者组完全缓解(CR)率明显高于DNMT基因部分阳性或阴性 患者组(P<0.01)。p15INK4B基因在56例AL患者中,31例(55.4％)完全甲基化,12例(21.4％)部分甲基化,14例 正常人在同一条件下则无1例甲基化。结论:DNMT基因在成人AL患者有异常高表达,其可能通过促使抑癌基因 启动子区域过甲基化,而使其转录失活,从而导致白血病恶性克隆的形成。对于高表达DNMT的AL患者,可能对 化疗更敏感,提示DNMT基因高表达可能是临床预后较好的指标。