5种β受体拮抗剂类药物中的N-亚硝基类杂质的含量研究

目的测定普萘洛尔、美托洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、比索洛尔原料药/制剂中N-亚硝基类杂质含量,明确其含量的关注阈值。方法采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱技术。以ACE Excel 3 C18-AR为色谱柱,以含0.01 mol/L乙酸铵的0.2%甲酸溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱,流速为0.60 mL/min,柱温为40℃,进样量为5μL;以可加热的电喷雾离子源为离子源,以全扫描-选择离子监测模式进行正离子扫描。采用该法对10家企业生产的15批β受体拮抗剂类药物原料药/制剂中N-亚硝基类杂质含量进行测定,并采用Discovery Studio软件对待测杂质进行毒性预测和关注阈值估算。结果5种β受体拮抗剂类药物中,N-亚硝基普萘洛尔、N-亚硝基美托洛尔、N-亚硝基阿替洛尔、N-亚硝基艾司洛尔、N-亚硝基比索洛尔检测质量浓度的线性范围分别为1.01~503.38、1.02~508.38、0.97~483.63、1.11~554.27、1.05~523.92 ng/mL(r>0.999),定量限分别为1.04、0.25、0.05、0.55、1.05 ng/mL,检测限分别为0.52、0.08、0.02、0.17、0.52 ng/mL,精密度、重复性、加样回收率、稳定性、耐用性试验的RSD均小于7.5%(n=6或n=5)。15批样品中,除1批样品外,其余批次均检出了N-亚硝基普萘洛尔(1.07~8.91 ng/mg)、N-亚硝基美托洛尔(1.43~3.37 ng/mg)、N-亚硝基阿替洛尔(1.33 ng/mg)、N-亚硝基艾司洛尔(0.19 ng/mg)、N-亚硝基比索洛尔(1.27 ng/mg)。经预测,上述5种杂质有不同程度的生育毒性、致突变性、致癌性,关注阈值分别为1.0、0.4、4.3、0.2、46.7 ng/mg。结论所建方法简单快捷、灵敏度高、专属性强,估算的关注阈值明确,可用于多种β受体拮抗剂类药物中N-亚硝基类杂质的含量控制。

N-亚硝基二甲胺和N-亚硝基二乙胺的小鼠重复给药毒性及遗传毒性研究

目的 连续7 d重复给予C57BL/6J小鼠N-亚硝基二甲胺(NDMA)和N-亚硝基二乙胺(NDEA),观察至首次给药后28 d,评价两者主要毒性靶器官及遗传毒性风险。方法 分设溶媒对照组(0.5%羧甲基纤维素钠),受试物组(分别给予0.75、1.50、3.00 mg·kg^(-1)NDMA或3.25、7.50、15.00 mg·kg^(-1)NDEA)和阳性对照组(200 mg·kg^(-1)甲磺酸乙酯、40 mg·kg^(-1)N-乙基-N-亚硝基脲)。溶媒对照组和受试物组连续7 d每天ig给药1次,阳性对照组连续3 d每天ig给药1次。末次给药后开展小鼠肝、肾和外周血彗星试验,计算每只动物的肝、肾和血细胞尾DNA百分含量(%Tail DNA)和尾距(tail moment)平均值。观察结束后(D28)开展小鼠磷脂酰肌醇聚糖A类(Pig-a)基因突变试验,计算网织红细胞(RETCD24-)和总红细胞(RBCCD24-)的突变率。并在末次给药和恢复期结束后,试剂盒法检测小鼠肝、肾和肺的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)水平、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测DNA损伤基因(ATM、gH2AX、Nbn、Prkdc、Trp)和肝药酶基因(CYP2E1、CYP2A6)。结果 NDMA剂量为3 mg·kg^(-1)时,动物全部死亡,自连续给药4 d后,NDEA 15 mg·kg^(-1)组小鼠体质量与溶媒对照组相比显著性降低(P<0.001);且NDMA和NDEA组与溶媒对照组在脏器系数、血液生化指标、组织病理学等方面存在显著差异(P<0.05、0.01、0.001),提示NDMA和NDEA对肝脏和肾脏存在一定毒性;NDMA和NDEA组小鼠肝、肾彗星试验结果均为阳性,Pig-a基因突变试验中NDEA高剂量组RETCD24-结果为阳性;与溶媒对照组比较,NDMA和NDEA组小鼠肝、肾和肺中8-OHdG含量显著升高(P<0.05、0.001),DNA损伤和肝药酶基因表达也存在显著差异(P<0.05、0.001)。结论 NDMA分别在1.5 mg·kg^(-1)剂量条件下产生肝脏毒性,0.75、1.50 mg·kg^(-1)剂量条件下使小鼠肝、肾细胞产生致突变性和肝、肾DNA损伤;NDEA可在15 mg·kg^(-1)剂量条件下产生肝脏毒性,并导致肝、肾细胞产生致突变性和DNA损伤;8-OHdG和DNA损伤基因等指标检测结果与NDMA和NDEA遗传毒性结果具有一定关联性。