自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响

目的探讨自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬的调节以及相关细胞因子表达的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组。对照组:仅使用正常DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:将ARPE-19细胞置于含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基中孵育12 h;3-MA组:使用含10 mmol·L^(-1)3-MA(美国Sigma-Aldrich公司)的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用正常DMEM-F12完全培养基孵育细胞12 h;3-MA联合A2E组:先使用10 mmol·L^(-1)3-MA预处理细胞1 h,再将细胞放入含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育12 h。使用CCK\|8法检测各组ARPE-19细胞增殖情况,透射电镜观察各组ARPE-19细胞超微结构,Western blot法检测各组ARPE-19细胞Beclin-1和P62自噬相关蛋白表达,免疫荧光染色法检测各组ARPE-19细胞自噬标志物LC3蛋白的表达,使用Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液10种细胞因子表达情况,10种细胞因子包括:细胞间黏附分子、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL^(-1)0、血管生成素2、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子、转化生长因子和VEGFA。结果与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞生存率下降了27.16%(P<0.01)。与A2E组相比,3-MA联合A2E组细胞培养上清液10种细胞因子含量均明显升高(均为P<0.01)。与对照组相比,3-MA组ARPE-19细胞超微结构无明显变化,而A2E组ARPE-19细胞胞浆内出现大量自噬泡;3-MA联合A2E组ARPE-19细胞自噬泡数量较A2E组明显减少。3-MA联合A2E组ARPE-19细胞胞浆内可见荧光斑点亮度较A2E组减弱,绿色荧光斑点数量也明显减少。与对照组相比,A2E组ARPE-19细胞Beclin-l蛋白相对表达量显著升高(P<0.001),P62蛋白的相对表达量显著降低(P<0.001)。与A2E组相比,3-MA联合A2E组ARPE-19细胞中Beclin-l蛋白相对表达量显著降低(P<0.01,),而P62蛋白相对表达量显著升高(P<0.001)。结论3-MA联合A2E作用下,ARPE-19细胞中炎症因子和血管生长因子的表达显著升高,自噬溶酶体数量及自噬蛋白的表达降低,自噬在年龄相关性黄斑变性的发生和发展中具有重要的调节作用。

自噬激活剂雷帕霉素对A2E诱导视网膜色素上皮细胞自噬调节的影响

目的探讨自噬激活剂雷帕霉素对N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞自噬调节的影响。方法取人RPE细胞(ARPE-19细胞系)进行培养。将细胞分为4组,其中,对照组:使用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;A2E组:使用含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素组:使用含100 nmol·L^(-1)雷帕霉素的DMEM-F12完全培养基预处理细胞1 h后,再用DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞;雷帕霉素联合A2E组:使用100 nmol·L^(-1)雷帕霉素预处理细胞1 h后,再用含20μmol·L^(-1) A2E的DMEM-F12完全培养基孵育ARPE-19细胞。使用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Procarta细胞因子分析试剂盒检测各组细胞培养上清液中细胞因子表达情况。透射电镜观察各组细胞超微结构,Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1和P62的表达,免疫荧光染色法检测各组细胞自噬标志物LC3蛋白的表达。结果与对照组相比,A2E组细胞生存率显著下降(P<0.001),而雷帕霉素联合A2E组细胞生存率得到了部分恢复,与A2E组相比差异有统计学意义(P<0.01)。与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中10种细胞因子含量均有所下降(均为P<0.01)。与对照组相比,雷帕霉素组细胞内出现散在自噬囊泡,A2E组细胞内出现较多的自噬囊泡,而雷帕霉素联合A2E组细胞内出现大量聚集的大体积的自噬囊泡。与对照组相比,A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.001),P62蛋白相对表达量显著降低(P<0.001);与A2E组相比,雷帕霉素联合A2E组中Beclin-1蛋白相对表达量明显升高(P<0.01),而P62蛋白相对表达量明显降低(P<0.001)。雷帕霉素联合A2E组ARPE-19细胞内LC3蛋白的绿色荧光斑点大量聚集,与A2E组相比荧光强度增加,斑点体积更大,数量也更多。结论雷帕霉素能够进一步激活A2E诱导的ARPE-19细胞自噬活性,一定程度上降低了A2E对RPE细胞造成的损伤,并抑制了ARPE-19细胞中炎症因子和血管生成因子的分泌。

脂褐素成分A2E诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及损伤的研究

目的探讨N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(A2E)能否诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19细胞)的自噬及损伤反应,并从自噬的角度探索其与年龄相关性黄斑变性(AMD)发病相关的分子机制。方法CCK-8法筛选A2E作用于ARPE-19细胞的最佳浓度用于后续实验。采用多重细胞因子检测技术检测A2E作用于ARPE-19细胞后对细胞间黏附分子(ICAM)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、促血管生成素-2(Ang-2)、胎盘生长因子(PIGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)以及血管内皮生长因子A(VEGFA)表达的影响,透射电子显微镜观察ARPE-19细胞超微结构的变化,免疫荧光标记检测细胞内自噬相关蛋白LC3的表达变化,Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达变化。结果依据CCK-8法检测结果,选择20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞用于后续实验。20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞后,细胞因子ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、IGF-1、TGF-β的表达水平自6 h起均有所升高,PIGF和VEGFA的表达水平在A2E作用12 h后也明显升高,与未给予A2E处理的对照相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。透射电子显微镜下可见,20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞1 h后细胞质内可见碗状、尚未收口的双层膜结构的“吞噬泡”,作用3 h、6 h、12 h时出现自噬体结构以及自噬溶酶体结构,自噬囊泡在A2E作用24 h时开始出现内容物减少,体积逐渐缩小。荧光显微镜下可见,与未给予A2E处理的对照相比,20μmol·L^(-1)的A2E作用于ARPE-19细胞6 h起即可见细胞质内LC3荧光呈现点状聚集,至12 h时荧光斑点数量达到最多、颗粒也最大、差异最明显,24 h时绿色荧光斑点数量开始下降,荧光强度也较前减弱。Western blot检测结果显示,与未给予A2E处理的对照相比,ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白的表达在A2E作用1 h、3 h、6 h、12 h及24 h时均显著升高,p62蛋白的表达在A2E作用1 h、3 h、6 h、12 h及24 h时均下降(均为P<0.05)。结论A2E能够刺激ARPE-19细胞分泌多种AMD相关炎症因子和新生血管因子,同时也能激活自噬潮,这为进一步研究自噬在AMD发病中扮演的角色提供了新的思路。

脂褐素与年龄相关性黄斑变性

年龄相关性黄斑变性(ARMD)是引起中老年人视力丧失的首要原因,其确切病因尚未明了,故治疗效果不佳。脂褐素随着年龄增长在视网膜色素上皮的积累是眼睛老化的标志,通过光化学作用等影响正常视网膜色素上皮细胞的功能,与ARMD的发生发展有一定联系。本文就脂褐素及其与ARMD的关系进行综述。