N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸对血小板洐生生长因子介导的NIH3T3细胞增殖的抑制调节作用

目的:探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(AcSDKP)对血小板洐生生长因子(PDGF)介导的NIH3T3细胞增殖的抑制调节作用。方法:采用MTT法和免疫组化法检测NIH3T3细胞增殖和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果:在 10-10～10-8mol／L浓度范围内,AcSDKP对PDGF介导的NIH3T3细胞增殖均有抑制作用,并在10-9 mol／L浓度时其抑制作用最佳。PDGF对NIH3T3细胞PCNA的表达具有增强作用,而AcSDKP对PDGF介导的NIH3T3细胞PCNA的表达有显著抑制作用。结论:AcSDKP对PDGF介导的NIH3T3细胞增殖有明显抑制作用。

3-乙酰硫基-2-甲基丙酰基-L-脯氨酸制备工艺的改进

目的 缩短3-乙酰硫基-2-甲基丙酰基-L-脯氨酸的生产周期，降低生产成本，提高收率和质量。方法 用Na2CO3作为催化剂，在L-脯氨酸溶液中滴加酰氯，经过滤，中和，冷却，制得3-乙酰硫基-2-甲基丙酰基-L-脯氨酸。结果 以酰氯计，收率38％以上，mp82～84℃，纯度99．85％（HPLC法）。结论 本法操作简便，收率高，成本低，适合工业化生产。

3-乙酰硫基-2-甲基丙酰基-L-脯氨酸的结晶体拆分工艺改进

目的 提高D - 3-乙酰硫基 - 2 -甲基丙酰基 -L -脯氨酸的质量和收率。方法 考察了不同结晶工艺水添加量,溶液pH值,温度及搅拌速度对D - 3-乙酰硫基 - 2 -甲基丙酰基 -L -脯氨酸收率和质量的影响。结果 新工艺在产品质量和收率方面均优于老工艺。结论 新工艺操作简便易行,稳定性好。

用L-脯氨酸衍生物作为手性流动相添加剂拆分对映异构体

用自制的N-十二酰基-L-脯氨酸和N-十二酰基-L-脯氨酸-3,5-二甲基苯胺两种L-脯氨酸衍生物作手性流动相添加剂,在氨丙基硅烷化硅胶柱上,用正己烷/异丙醇作流动相,对多种手性化合物进行了高效液相色谱拆分。实验结果表明:用N-十二酰基-L-脯氨酸作添加剂拆分的12种手性化合物,有8种手性化合物能得到拆分,具有较好的手性选择性。虽然用N-十二酰基-L-脯氨酸-3,5-二甲基苯胺作添加剂,手性选择性也较好,但由于含有苯环,紫外吸收增强,基线波动严重。

基于N-十二酰基-l-脯氨酸为载体的对映异构PVC膜选择性电极的研制

合成了手性物质N-十二酰基-l-脯氨酸(N-DDO-l-Pro)(脯氨酸,Pro),作为PVC膜电极的载体,在PVC膜表面与被测试液中Cu(II)与脯氨酸形成的配合物[Cu(II)(l-Pro)2]或[Cu(II)(d-Pro)2]进行配体交换,形成[(l-Pro)Cu(II)(N-DDO-l-Pro)]或[(d-Pro)Cu(II)(N-DDO-l-Pro)]配合物.由于生成的配合物热力学稳定性不同,电极能优先响应l-Pro,线性范围10-4～10―1mol·L-1,斜率57mV·dec-1,检测限3.89×10-5mol·L-1.电极能够对脯氨酸进行手性检测,其对映选择性系数lgKlp,odt为-3.19.

3-O-C_(12)-HSL通过抑制lncRNA CD48-AS和CD48的表达而阻碍Mo-DCs成熟

目的筛选并阐明长链非编码RNA(lncRNA)CD48-AS与其反义互补分子CD48 m RNA在N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)阻碍人单核细胞诱导的树突状细胞(Mo-DCs)成熟过程中发挥作用的机制。方法从健康人外周血中分离Mo-DCs,将未成熟的Mo-DCs细胞分为阴性对照组(0.1%DMSO)、脂多糖(LPS)阳性对照组(100μg/L的LPS)和实验组(100μg/L LPS+40μmol/L 3-O-C_(12)-HSL)进行lncRNA芯片检测。筛选lncRNA表达谱中差异表达5倍以上的自然反义lncRNA进行聚类分析,从中筛选差异具有统计学意义的自然反义lncRNA CD48-AS。未成熟的Mo-DCs分为阴性对照组、LPS阳性对照组以及LPS+C5、C10、C25实验组(分别加入5、10、25μmol/L的3-O-C_(12)-HSL)。利用荧光定量PCR检测lncRNA CD48-AS和反义分子CD48 mRNA在实验体系中的表达水平;通过生物信息学分析lncRNA CD48-AS与CD48反义互补区及其蛋白编码功能;通过核糖核酸酶保护实验(RPA)验证lncRNA CD48-AS是否与CD48形成二聚体,从而通过影响靶CD48的表达来发挥调控作用。最后检测lncRNA CD48-AS在细胞内的定位。结果 3-O-C_(12)-HSL处理Mo-DCs后lncRNA表达谱出现了特异性改变。3-O-C_(12)-HSL可下调由LPS诱导的Mo-DCs中lncRNA CD48-AS及其反义靶分子CD48的表达。生物信息学分析lncRNA CD48-AS不具备蛋白编码功能,为非编码RNA;lncRNA CD48-AS与CD48形成RNA二聚体从而减少RNA酶对CD48 mRNA的降解,使得CD48 mRNA表达增加;lncRNA CD48-AS在Mo-DCs中主要定位在细胞核中,细胞质中表达量较少。结论 3-O-C_(12)-HSL可通过下调lncRNA CD48-AS,进而影响CD48的表达来阻碍Mo-DCs的成熟。

miR-155在3-oxo-C12-HSL阻碍人单核细胞源性树突状细胞成熟过程中的表达变化

目的探讨miR-155在N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)阻碍人单核细胞源性树突状细胞(Mo-DCs)成熟过程中的表达变化。方法分离正常人外周血CD14+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人IL-4诱导分化为Mo-DCs。将不成熟Mo-DCs分为阴性对照组、模型组、实验组1、实验组2,阴性对照组加入同体积PBS,模型组加入终浓度为1μg/m L的LPS,实验组1和实验组2分别加入终浓度为1μg/m L的LPS后分别加入终浓度为50μmol/L和100μmol/L的3-oxo-C12-HSL,处理48 h。采用流式细胞术检测各组Mo-DCs表型(CD80、CD40、CD11c和HLA-DR),酶联免疫吸附法检测细胞培养上清细胞因子(IL-12、IL-10)水平,荧光定量PCR检测miR-155表达。结果与阴性对照组相比,模型组CD80、CD40、HLA-DR表达高,IL-10水平低,IL-12水平高,miR-155表达高(P均<0.05)。实验组1、实验组2与模型组相比,实验组2与实验组1相比,CD80、CD40、HLA-DR表达低,IL-10水平高,IL-12水平低,miR-155表达低(P均<0.05)。结论 miR-155在3-oxo-C12-HSL阻碍人Mo-DCs成熟过程中表达降低,3-oxo-C12-HSL可能通过降低miR-155表达阻碍Mo-DCs成熟。

佛波酯磷脂酰-L-丝氨酸(PEPS)中间体的合成工艺改进

目的改进佛波酯磷脂酰-L-丝氨酸(PEPS)的中间体3-苄基-2-(8-叔丁基二苯基硅氧辛酰基)-1-三苯甲基-sn-甘油(9)和N-叔丁氧羰基-L-丝氨酸二苯甲酯(11)的合成工艺。方法以D-甘露醇为原料,经丙叉基保护、氧化-还原、苄基保护、脱丙叉保护、选择性保护、酯化、羧基还原、硅烷基保护合成化合物9;以L-丝氨酸为原料,经氨基、羧基保护合成化合物11。结果与结论目标化合物的结构经1H-NMR谱确证,改进后的工艺,缩短了合成路线,简化了柱色谱分离、纯化步骤,具有原料易得,操作简便,成本低廉的优点。

3-O-C12-HSL通过PPARγ拮抗树突状细胞表达RP11-367F23.2

目的 研究N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C 12 -HSL)是否抑制单核细胞来源树突状细胞(Mo-DCs)表达RP11-367F23.2,该抑制作用是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)介导。方法 采用密度梯度离心法分离单核细胞来源的Mo-DCs;将Mo-DCs细胞分为4组:脂多糖(LPS)组、3-O-C 12 -HSL组、GW9662组和PBS组,18 h后收集细胞;荧光定量PCR检测4组中RP11-367F23.2表达情况。结果 Mo- DCs经3-O-C 12 -HSL刺激后,RP11-367F23.2表达量降低,3-O-C 12 -HSL组和LPS组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05);Mo-DCs经GW9662处理后,细胞中的RP11-367F23.2表达量升高,3-O-C 12 -HSL组和GW9662组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05)。结论 3-O-C 12 -HSL通过PPARγ拮抗Mo-DCs表达RP11-367F23.2。

3-O-C_(12)-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程中lncRNA表达谱的变化

目的:观察铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerltginosa,PA)分泌的信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-oxododecanoy1-L-homoserine lactone,3-O-C12-HSL)阻碍单核细胞来源的树突细胞(monocytes derived-dendritic cells,Mo-DCs)成熟过程中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)表达谱的变化情况。方法:采用免疫磁珠法分选人外周血CD14+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4诱导分化为Mo-DCs。不同因素处理Mo-DCs,实验组加入终浓度0.1μg/m L的LPS和终浓度为40μmol/L的3-O-C12-HSL,对照组加入相应体积的含0.1%DMSO的PBS,模型组加入终浓度0.1μg/m L的LPS。利用lnc RNA芯片技术检测对照组、模型组和实验组间lnc RNA表达谱的差异。对筛选数据进行分析处理,利用散点图分析2倍以上差异lnc RNA在各处理因素间的总体变异情况,利用聚类分析研究表达差异5倍以上lnc RNA的聚类情况。结果:与对照组和模型组相比较,实验组筛选出2倍以上表达差异的lnc RNA为1 386条,其中上调表达的548条,下调表达的838条。筛选出具有5倍以上表达差异的lnc RNA共153条,占2倍表达差异lnc RNA的11.04%,其中上调表达的22条,下调表达的131条。散点图发现2倍表达差异的lnc RNA总体分布呈集中趋势,存在特征性改变。聚类分析发现5倍表达差异的lnc RNA能根据处理因素进行有效的分层聚类。结合GO分析和m RNA通路分析,差异lnc RNA的相关基因可富集至PPAR信号通路、钙信号通路和NF-κB信号通路中。结论:3-O-C12-HSL作用于Mo-DCs后,lnc RNA表达谱发生了特征性变化,表达差异的lnc RNA可能参与了3-O-C12-HSL阻碍Mo-DCs成熟过程。

3-O-C_(12)-HSL通过PPARγ介导Mo-DCs表面CD1d的表达

目的研究N-3-氧化十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)是否促进人单核细胞衍生树突状细胞(Mo-DCs)表达CD1d,该作用是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)介导。方法取健康人外周血80 m L,密度梯度离心法获得单个核细胞,免疫磁珠法分选CD14+单核细胞,重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4诱导5 d,使其分化为Mo-DCs。将Mo-DCs细胞分为4组,阳性对照组加入终浓度为0.1μg/m L的脂多糖(LPS);阴性对照组加入相应体积的含0.1%DMSO的PBS;3-O-C_(12)-HSL实验组分3个浓度水平,在加入LPS的基础上分别加入终浓度为10、20和40μmol/L的3-O-C_(12)-HSL;GW9662实验组为GW9662预处理1 h后分别加入LPS和浓度为10、20、40μmol/L的3-O-C_(12)-HSL。流式细胞术检测Mo-DCs表面CD1d的表达量;使用PPARγ的抑制剂GW9662处理Mo-DCs后,再经LPS和(或)3-O-C_(12)-HSL刺激,流式细胞术检测Mo-DCs表面CD1d的表达量。结果 Mo-DCs经3-O-C_(12)-HSL刺激后,表面分子CD1d表达水平增加,与阴性对照组及阳性对照组差异有统计学意义(P<0.05);Mo-DCs经GW9662处理1 h后,再加入3-O-C_(12)-HSL,Mo-DCs表面CD1d表达量明显降低(P<0.05)。结论 3-O-C_(12)-HSL通过PPARγ促进Mo-DCs表面CD1d的表达。

铜绿假单胞菌信号分子3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD的结合特性研究

目的制备纯化的人过氧化物酶体增殖物激活受体-配体结合域(PPARγ-LBD)肽段并观察铜绿假单胞菌信号分子N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)与PPARγ-LBD的结合强度。方法采用分子对接的方式预测3-O-C_(12)-HSL与PPARγ的结合位点。合成PPARγ-LBD基因序列并插入pET28b质粒,鉴定后通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组肽段,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot分析。表面等离子体共振技术检测3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD的结合动力学参数。结果分子对接结果显示3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD区的Tyr473和Tyr327形成氢键,3-O-C_(12)-HSL末端柔性碳链与PPARγ-LBD区的Met329、Leu330等残基形成疏水结合。制备获得人PPARγ-LBD肽段,经SDS-PAGE及Western blot检测在25~35 ku有一条蛋白的印迹,与PPARγ-LBD分子质量一致。3-O-C_(12)-HSL与PPARγ结合的亲和力常数为1.65×10^(-4) mol/L,结合速率常数为1.06×10^(2)/ms,解离速率常数为1.75×10^(-2)/s。结论3-O-C_(12)-HSL与PPARγ-LBD功能区结合能力强于PPARγ特异性拮抗剂GW9662,为制备针对3-O-C_(12)-HSL的特异性靶向药物提供了实验依据。

3-O-C_(12)-HSL通过PPARγ介导Mo-DCs表达CD40

目的研究铜绿假单胞菌信号分子N-3-氧化十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C_(12)-HSL)是否促进人单核细胞衍生树突细胞(Mo-DCs)表达CD40,该作用是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)介导。方法取健康人外周血,密度梯度离心法获得单个核细胞,免疫磁珠法分选CD14^+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人白细胞介素-4(IL-4)诱导,使其分化为Mo-DCs,MoDCs经脂多糖(LPS)和(或)3-O-C_(12)-HSL刺激后,流式细胞术检测Mo-DCs表面CD40的表达量。使用PPARγ的抑制剂GW9662处理Mo-DCs后,再经LPS和(或)3-O-C_(12)-HSL刺激,流式细胞术检测MoDCs表面CD40的表达量。结果 Mo-DCs经3-O-C_(12)-HSL刺激后,表面分子CD40表达水平降低,与PBS组及LPS组差异有统计学意义(P<0.05);Mo-DCs经GW9662处理后,再加入3-O-C_(12)-HSL,MoDCs表面CD40表达量明显增加(P<0.05)。结论 3-O-C_(12)-HSL通过PPARγ降低Mo-DCs表面CD40表达。

血清LncRNA-ENST00000420480在铜绿假单胞菌感染中诊断价值

目的探讨长链非编码RNAENST00000420480作为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染诊断标志物的临床价值。方法采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,免疫磁珠分选人CD14+单核细胞、hIL?4和hGM?CSF诱导分化为单核细胞衍生树突细胞(monocytes derived dendritic cells,Mo?DCs),分PBS组、LPS组和LPS+3?O?C12?HSL组。实时荧光定量PCR检测lncRNA?ENST00000420480表达量。收集临床PA感染患者血清21例,体检表观健康人血清32例,提取血清RNA,逆转录获得cDNA,荧光定量PCR检测lncRNA?ENST00000420480表达量,受试者工作特征曲线评价血清中lncRNA?ENST00000420480对PA感染的诊断效能,计算约登指数(YI)明确PA感染诊断截点(cut?off)。结果与PBS组相比,LPS下调Mo?DCs中lncRNA?ENST00000420480表达水平。与LPS组相比,3?O?C12?HSL上调Mo?DCs中lncRNA?ENST00000420480表达水平。PA感染组血清中lncRNA?ENST00000420480相对表达量为(3.85±4.18),正常人组血清中lncRNA?ENST00000420480相对表达量为(1.30±1.06),差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线中AUC为0.708(P=0.01),YI为0.429,诊断截点值为4.13。结论lncRNA?ENST00000420480可作为PA感染的血清学标志物。

3-O-C_(12)-HSL作用下Mo-DCs的circRNA表达谱与功能富集分析

目的探讨单核细胞来源树突状细胞(Mo‐DCs)在N-3-氧化十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3‐O‐C_(12)‐HSL)作用下其环状RNA(circRNA)表达谱的影响及功能富集。方法取健康志愿者新鲜外周血,经Fi‐coll密度梯度离心及免疫磁珠分选获得CD14+单核细胞,重组人白细胞介素-4(hIL‐4)、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM‐CSF)细胞因子诱导分化为Mo‐DCs,将细胞用0.1μg/mL脂多糖(LPS)(LPS组、阳性对照)、0.1%二甲基亚砜(DMSO)(DMSO组、阴性对照)或25μmol/L 3‐O‐C_(12)‐HSL和0.1μg/mL LPS(3‐O‐C_(12)‐HSL组)分别处理。采用Arraystar CircRNA芯片筛选三组差异表达的circRNA,并对差异表达circRNA靶基因作功能富集分析。结果circRNA微阵列分析检测到12967个circRNA在Mo‐DCs中表达,根据P<0.05和FC≥1.2的标准进行筛选,与LPS组相比,3‐O‐C_(12)‐HSL组有122个circRNA显著上调,77个显著下调;与DMSO组相比,3‐O‐C_(12)‐HSL组有64个circRNA显著上调,122个显著下调。GO和KEGG富集分析表明,差异表达的circRNA亲本基因主要富集于转化生长因子-β、趋化因子、ErbB等信号通路上,主要参与树突状细胞分化、Fcγ受体介导的吞噬作用及淋巴细胞分化调节等过程。通过ENCORI数据库预测大量miRNA与circRNA存在结合位点,并构建了ceRNA网络图。结论3‐O‐C_(12)‐HSL影响了Mo‐DCs成熟过程中circRNA的表达。

3-O-C_(12)-HSL通过PPARγ抑制Mo-DCs表达IL-6

目的研究铜绿假单胞菌分泌的N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(N-3-oxododecanoyl-L-homoserine lactone,3-O-C12-HSL)是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferater-activated receptorγ,PPARγ)调节单核细胞来源的树突细胞(monocytes derived-dendritic cells,Mo-DCs)表达白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)。方法 PPARγ配体筛选实验体外检测3-O-C12-HSL是否与PPARγ结合。免疫磁珠法分选人CD14+单核细胞,人白细胞介素4(human Interleukin 4,h IL-4)及人粒单核细胞集落刺激因子(human granulocyte monocyte colony stimulating factor,h GM-CSF)诱导分化为Mo-DCs,不同浓度的3-O-C12-HSL处理Mo-DCs;PPARγ拮抗剂GW9662处理Mo-DCs后,3-O-C12-HSL处理Mo-DCs,电化学发光法检测Mo-DCs培养上清IL-6浓度。结果配体筛选实验显示3-O-C12-HSL>4.60μmol/L时可竞争性结合PPARγ配体结合区。3-O-C12-HSL下调脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的Mo-DCs表达IL-6水平(P<0.05),PPARγ特异性拮抗剂GW9662能部分逆转3-O-C12-HSL介导的IL-6表达下调(P<0.05)。结论 3-O-C12-HSL可与PPARγ相结合,并通过PPARγ调节Mo-DCs分泌表达IL-6。

马来酸依那普利的合成与表征

研究了由3-苯甲酰丙烯酸乙酯和L-丙氨酸苄酯对甲苯磺酸盐缩合并用Pd/C催化加氢还原合成N-[(S)-1-(乙氧羰基)-3-苯丙基]-L-丙氨酸,再用双(三氯甲基)碳酸酯进行酰氯化,最后与L-脯氨酸直接缩合成盐获得马来酸依那普利的新方法。产品总收率为50%。对产品结构进行了表征。

赖诺普利关键中间体的合成研究

以3-苯甲酰丙烯酸乙酯(BZ)和三氟乙酰赖氨酸(LA1)为原料,在三氟甲磺酸三正丁胺盐催化作用下,经迈克尔加成反应、氢化还原反应合成赖诺普利关键中间体N2-(1-乙氧羰基-3-苯丙基)-N6-三氟乙酰基-L-赖氨酸(LA2),总收率为38.8%。LA2加成物立体选择性可达到84:16。该方法具有操作简单,收率高,是一条适合工业化生产的合成路线。

铜绿假单胞菌OdDHL免疫应答及其防控策略的研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)释放的小分子信号N-(3-氧代十二酰基)-高丝氨酸内酯[N-(3-oxododecanoyl)-l-homoserine lactone, OdDHL]能控制生物膜的形成和毒力因子等表达,加重宿主的感染并影响免疫反应。细菌使用小分子信号驱动细菌细胞之间的通讯,以应对周围微生物群落的细胞密度和物种组成的变化,这一过程被称为群体感应(quorum sensing, QS)。现就铜绿假单胞菌QS释放小分子信号OdDHL的合成与调节、介导的免疫应答和以OdDHL为靶点的感染防控策略作一概述。