基因工程酶法生产N-氨基甲酰-D-对羟基苯甘氨酸反应条件的优化(英文)

为了实现利用生物酶转化法生产D 对羟基苯甘氨酸 ,以工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht细胞作酶源 ,对底物对羟基苯海因到中间体N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸的酶转化条件进行了优化 .酶转化的最适温度为 37℃ ,最适pH为 9 0 .在Tris HCl、磷酸盐、碳酸盐和硼酸盐 4种缓冲体系中 ,底物对羟基苯海因的转化率相近 .菌体细胞经适当冻融后 ,底物对羟基苯海因的转化率被提高 .水溶性有机溶剂DMSF、DMF和Tween 80使对羟基苯海因的转化率降低 .转化时底物和菌体的合适比例为 30g L对羟基苯海因和 10g L湿菌体 .经工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht细胞催化 ,底物的转化率在 13h内可达到 96 % .所制备的产物熔点。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的快速纯化及性质

通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析及阴离子交换层析等三步 ,有效地从一菌株NO .2 2 6 2中纯化了N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶。结果表明 ,酶活性回收约 2 0 %,纯化了 8 4倍。天然PAGE与SDS PAGE分析表明 ,该酶分子为同源四聚体 ,单体分子量约为 3 5kD。酶催化反应的最适pH为 7 7～ 8 0 ,最适温度为 45℃。以N 氨甲酰 DL 丙氨酸为底物时 ,Km =1 3×1 0 - 3 mol L ,Vmax=0 .3 3mol min。二价金属离子Ni2 + 有激活作用 ,Zn2 + 有明显的抑制作用 ,而Co2 + 对酶活无影响。该酶N 末端 8个氨基酸残基依次为TRQKILAF。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达

按本室纯化的N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶 (DCase)的N 末端氨基酸序列设计了正向引物 ,并在已报道的不同来源菌株DCase的氨基酸序列同源性分析的基础上 ,设计了反向引物。用菌株No . 2 2 62总DNA为模板 ,经PCR扩增获得长度为约0 9kpb的片段 ,DNA序列分析表明基因全长为 912bp。将该片段插入 pET 3a ,构建成重组子 pET DCase ,并在E coliDH5α中获得表达 ,经SDS PAGE检测 ,表达产物分子量与天然纯DCase相同 ,约为 35kD。

N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的融合表达、纯化和酶活性

将菌株SS-ori的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(DCase)插入到pMAL-c2X载体中,构建表达产物为麦芽糖结合蛋白(MBP)与DCase融合的重组子。该重组子在E.coliBL21中的表达产物为融合蛋白MBP-DCase(76.4ka),光密度扫描表明,其表达量约占菌体超声后离心上清总蛋白的19%。经Amy-lose亲和纯化和Superose12凝胶排阻层析后达到了电泳纯。根据pMAL-c2X的背景,用FactorXa剪切后,可得约41.7ka的MBP和34.7ka的DCase。酶活性检测表明当用N-氨甲酰-DL-缬氨酸做为底物,A600=10时,每升菌体每小时可产生D-缬氨酸0.78g。

N-对氟苯甲酰基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-氨基葡萄糖的合成

以D-氨基葡萄糖盐酸盐和对氟苯甲酸为原料,先将氨基葡萄糖的羟基加以保护,然后以DCC为脱水剂,合成了未见文献报道的产物N-对氟苯甲酰基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-氨基葡萄糖.探讨形成目标化合物最佳反应条件,该法反应条件温和,产率高.目标化合物结构经IR,1HNMR和13CNMR表征得以确认.

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育

以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株,应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变,经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选,获得高产、稳定的优良菌株MF0506。经过发酵培养基优化,诱变株的产酶活力由出发菌株的0.443u/ml提高至0.680u/ml。

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺

以TJS环氧基树脂作为载体对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化,最佳工艺条件为:1g树脂载体大约对应133U酶液,蛋白质量浓度0.35mg/mL,固定时间15h,温度28℃,pH7.5,固定化酶活达到58.5U。蛋白固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,得到的固定化酶使用半衰期达到26批。

N-硝基苯甲酰基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-氨基葡萄糖的合成与表征

以D-氨基葡萄糖盐酸盐、间硝基苯甲酸和对甲基苯甲酸为原料,先将氨基葡萄糖的羟基加以保护,然后以N,N-二环已基碳二亚胺(DCC)为脱水剂,合成N-硝基苯甲酰基-1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-氨基葡萄糖.产品结构经傅里叶变换红外光谱(FT-IR)及核磁共振氢谱(1 H NMR)表征确认.研究表明:1,3,4,6-四-O-乙酰基-2-脱氧-β-D-氨基葡萄糖、DCC和间硝基苯甲酸/对甲基苯甲酸的摩尔比为1∶1.5∶1.5,反应温度为40℃,反应时间为4h为最佳反应条件.

N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶研究进展

用生物转化法生产D 氨基酸已经成为国内外半合成抗生素行业的支柱之一。此外 ,D 氨基酸及其衍生物还是甜味剂、拟除虫菊脂、多肽激素等诸多产品的重要中间体。介绍D 氨基酸生物转化中N 氨甲酰基 D 氨基酸酰胺水解酶的一些生化性质。

重组大肠杆菌共表达D-海因酶和N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶

通过PCR分别扩增得到N-carbamoylase基因和上游带有RBS区的D-hydantoinase基因,并将其依次克隆入pBAD/HisA质粒中,得到呈多顺反子结构的双酶表达质粒pBAD-CRH,转化E.coliTop10F′得到重组菌TaraCRH.实验证明,E.coliTaraCRH对外源蛋白的表达控制严紧,而加入阿拉伯糖诱导后可以成功表达两酶基因.诱导条件优化结果表明,诱导温度采用29℃,培养基中阿拉伯糖浓度0.05g/L可达到最高酶活.进一步尝试采用玉米浆培养基代替LB培养基,在经过优化的玉米浆培养基中培养TaraCRH菌株,经阿拉伯糖诱导,海因酶和水解酶酶活分别达到3.52和4.21U/mL.

高效液相色谱法测定D-对羟基苯甘氨酸

建立了反应体系中 D-对羟基苯甘氨酸、N-氨甲酰 - D-对羟基苯甘氨酸、DL-对羟基苯海因 3者含量的测定方法。采用高效液相色谱法测定 ,以 Kromasil- C18为固定相 ,φ(乙腈 )∶ φ(水 )∶ φ(磷酸 (85 % ) ) =10∶ 90∶0 .0 1为流动相 ,紫外检测波长为 2 10 nm。3者回收率分别为 99.5 % ,98.6 %及 99.6 % ,RSD为 0 .11% ,0 .13%和0 .2 1%。实验结果表明该法简便、快速。

双酶法合成中D-对羟基苯甘氨酸及其中间体的测定

建立了双酶法合成中D 对羟基苯甘氨酸及其中间体N 氨甲酰基 D 对羟基苯甘氨酸的定量检测方法 :前者通过测反应混合物中NH4+ 的增加来定量 ,后者则以PDAB显色定量。此法对NH4+ 和N 氨甲酰基 D 对羟基苯甘氨酸的回收率分别为 97.7%～ 10 2 .5 %和 98.4 %～ 10 1.7%。

D-对羟基苯甘氨酸生产过程的高效毛细管电泳法分析

建立了高效毛细管电泳法测定酶法反应体系中D-对羟基苯甘氨酸、DL-对羟基苯海因、N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸的含量。采用未涂层石英毛细管柱,运行缓冲液为20mmol/L硼砂缓冲液(pH9.0),检测波长230nm。分离电压30kV,进样压力0.5psi,进样时间5s,采用苯酚为内标。三成分均在0.01%～0.1%范围内线性关系良好。

3,5-双-O-苯甲酰基-2-脱氧-2,2-二氟-1-氧代-D-呋喃核糖的合成与表征

以N,N-二甲基-4-氨基吡啶为催化剂,用3R,3S-2-脱氧-2,2-二氟-1-氧代-D-呋喃核糖和苯甲酰氯反应,合成了药物Gemcitabine的关键中间体3,5-双-O-苯甲酰基-2-脱氧-2,2-二氟-1-氧代-D-呋喃核糖,用元素分析、IR与1H NMR对其结构进行了表征。用异丙醇作溶剂进行重结晶,分离出非对映异构体产物。讨论了不同催化剂、反应温度和反应物比对反应的影响。

海因酶产生菌的反应条件研究

利用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)作为酶源,研究海因酶催化DL-对羟基苯海因合成N-氨基甲酰-D-对羟基苯甘氨酸,以制备D-对羟基苯甘氨酸,并就培养基的优化,反应条件的选择及酶活的影响作了探讨.研究表明,碱性条件下可显著增加酶反应速度,温度对提高海因酶活力有重要影响.培养初始pH值为7.0,温度28℃下培养24 h产海因酶达最高;在最适pH9.0和最适温度55℃下,海因酶活力达到0.7 u/mL,比原基础培养条件下提高3.5倍.

DCase水解酶固定化的性质

以TJS环氧基树脂作为载体,对N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶进行固定化研究。最佳工艺条件如下:1 g树脂载体大约对应133 U酶液,蛋白质量浓度为0.35 mg/mL,固定时间为15h,温度为28℃,pH值为7.5,固定化酶活力达到58.5 U·g^(-1),固定率可达97.4%,酶活回收率达到49.3%,固定化酶活半衰期长达14 d。

恶臭假单胞菌Pseudo monas JS-01的发酵动力学

利用自动控制发酵设备 ,首先进行分批发酵实验摸索恶臭假单胞菌PseudomonasJS 0 1的生长与代谢的基本规律 ,然后采用补料分批发酵的方法限制生长基质的浓度 ,测定了一系列 (Ci,μi) ,(μj,qij)数据 ,获得了Kc、μmax、α、β等参数的值 ,并且推导出了细胞生长与产物合成的动力学公式 ,从而证明了用Monod方程描述恶臭假单胞菌PseudomonasJS 0 1生长速率与基质浓度关系的合理性 。

D-海因酶和水解酶在中华根瘤菌中的增强表达

以质粒pBBR1MCS-5为载体,将D-Case和D-Hase基因以多顺反子形式置于其lac启动子控制下,转入中华根瘤菌,经30℃发酵培养24 h,在不添加诱导剂的情况下,总酶活比野生菌提高了2倍.为减少葡萄糖效应,将lac启动子替换成lacUV5,对核糖体结合位点进行优化,工程菌的酶活比野生菌提高了4倍,达0.5 U/mL.