N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶在肺癌H446多药耐药细胞中的表达

目的本研究旨在观察N-甲基化嘌呤-DNA-糖基化酶在小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/CDDP中的表达情况。方法以本所前期诱导成功的小细胞肺癌多药耐药细胞系H446/CDDP为研究对象,H446亲代细胞为对照,采用半定量RT-PCR法检测MPG基因mRNA的转录水平,免疫细胞化学法检测其蛋白表达。结果半定量RT-PCR显示,H446细胞MPG基因mRNA的转录量为0.19±0.15,H446/CDDP细胞为0.75±0.08;免疫细胞化学显示,H446/CDDP、H446细胞MPG蛋白表达呈阳性,均表达于细胞核。结论MPG的高表达可能同人小细胞肺癌多药耐药的产生有关。

电化学循环放大法检测腺嘌呤甲基转移酶的活性

DNA甲基转移酶(Dnmt)可以催化DNA的甲基化反应的发生。生物体内DNA异常甲基化可能导致肿瘤的发生和演进。因此,在疾病的治疗和预防中,Dnmt可能成为一个重要的分子靶标。本文以DNA腺嘌呤甲基转移酶(Dam)为研究对象,设计了含-GATC-特定序列的双链DNA和巯基标记及二茂铁基团的两条互补DNA链作为阴阳探针,从Dam和核酸内切酶DpnI的特异性识别作用出发,利用核酸链之间的竞争性杂交实现对甲基转移酶活性的检测,并利用λ核酸外切酶特异性识别作用,构建电化学循环放大检测甲基转移酶活性的新方法来提高检测的灵敏度。

支气管灌洗液抑癌基因过甲基化对肺癌诊断价值的研究

目的探讨支气管灌洗液抑癌基因过甲基化对肺癌诊断的应用价值。方法选取北京市结核病胸部肿瘤研究所收治怀疑肺癌患者78例,包括肺癌51例和良性病变患者27例,从支气管灌洗液上清和细胞提取DNA,对上清游离DNA进行定量分析,并采用NMSP完成对支气管灌洗液上清和细胞的过甲基化分析,所选择的靶基因包括p16,MGMT以及RASSF1A基因。将NMSP结果与临床诊断比较,计算敏感性和特异性。结果中心型肺癌、周围型肺癌和肺部良性病变支气管灌洗液上清游离DNA含量没有显著差异。支气管灌洗液细胞抑癌基因过甲基化诊断中心型肺癌的敏感性和特异性分别为85.2%和81.5%,诊断周围型肺癌的敏感性和特异性分别为54.2%和81.5%。支气管灌洗液上清和细胞抑癌基因过甲基化诊断中心型肺癌的敏感性和特异性为88.9%和70.4%,诊断周围型肺癌的敏感性和特异性为75.0%和70.4%。结论支气管灌洗液抑癌基因的过甲基化可为肺癌诊断提供帮助。

哺乳动物基因组中由DNA聚合酶掺入的N^6-甲基腺嘌呤

中国科学院生态环境研究中心汪海林研究团队在生物分析与表观遗传领域取得新进展。该研究在哺乳动物细胞系中检测到的DNA N^6-甲基腺嘌呤(6mA)并不依赖于甲基化转移酶,并发现了DNA聚合酶依赖的DNA 6mA新来源。相关研究工作以“N^6-methyladenine is incorporated into mammalian genome by DNA polymerase”(N^6-甲基腺嘌呤由DNA聚合酶掺入哺乳动物基因组)为题于2020年4月30日在线发表于Cell Research(https://doi.org/10.1038/s41422-020-0317-6)。

评价替莫唑胺对脑胶质瘤治疗敏感性的新方法

背景与目的:替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是治疗胶质母细胞瘤的唯一化疗药。O^6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT)基因启动子甲基化是评价TMZ敏感性的唯一指标。但通过检测MGMT的甲基化程度来评估TMZ的敏感性是不够的,因为目前MGMT检测只是定性检测,而且这种检测只能反映DNA损伤修复的一条通路,而另两条通路的修复情况却没有反映出来。方法:该研究一方面是应用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM),对MGMT的甲基化进行定量检测,同时应用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQPCR)来探讨另外两条修复通路蛋白N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶(N-methylpurine DNA glycosylase,MPG)和人类烷烃羟化酶基因同系物2(alkane hydroxylase gene homolog 2,ALKBH2)的mRNA表达。将MPG和ALKBH2的表达分为高表达和低表达。结果:结合MGMT的甲基化(阳性)和非甲基化(阴性)程度,再把MPG和ALKBH2结合起来评估患者对TMZ的敏感性。三阳性(MGMT非甲基化,MPG阳性和ALKBH2阳性)为化疗抵抗,两阳性为不敏感,两阴性为次敏感,三阴性(MGMT甲基化,MPG阴性和ALKBH2阴性)为最敏感。结合8例胶质母细胞瘤患者的检测和生存期,结果与我们的判断结果相吻合,三阴性的患者生存时间最长,三阳性的患者的生存时间最短。结论:通过定量检测MGMT同时结合MPG和ALKBH2可以更精准地判断TMZ的敏感性。

重组人源MPG基因真核表达载体构建及转染非小细胞肺癌多药耐药细胞的研究

目的构建人N甲基化嘌呤DNA糖基化酶(NmethylpurineDNAglycosylase,MPG)基因真核表达载体,并研究其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞中的表达情况。方法应用分子克隆技术构建pCMVScript/MPG重组真核表达载体;应用脂质体介导的基因转染技术将其导入人非小细胞肺癌多药耐药细胞株A549/CDDP内;应用G418筛选稳定表达的转染细胞;应用PCR检测pCMVScript载体上的NEOr基因,应用RTPCR及Westernblot检测MPG基因的表达。结果构建产物经限制性酶切分析及基因序列测定证实为pCMVScript/MPG重组表达载体;转染pCMVScript/MPG载体组(MP组)及转染pCMVScript载体组(P组)细胞内检测到NEOr基因,未转染组(C组)则未检测到;MP组细胞内MPGmRNA水平较P组及C组细胞显著增高(P<0.01);MP组细胞内MPG蛋白质水平较P组及C组细胞显著增高(P<0.01)。结论成功地构建了人MPG基因表达载体,并在人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/CDDP获得了稳定、高效的表达。

线粒体靶向MPG基因重组体对人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/DDP增殖的抑制作用

背景与目的:多药耐药是影响肺癌化疗效果的重要因素。本研究拟构建线粒体靶向人N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶(MPG)基因真核表达载体,观察其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞线粒体内的表达情况,并研究其对多药耐药细胞增殖的抑制作用。方法:应用重叠延伸剪接技术重组锰超氧化物歧化酶(MnSOD)线粒体靶向序列-MPG融合基因(mito-MPG);构建pCMV-Script/mito-MPG重组真核表达载体;脂质体将其转染至人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/DDP;G418筛选稳定表达的转染细胞;RT-PCR检测mito-MPG基因mRNA的表达水平;分离线粒体蛋白后应用Westernblot检测MPG在线粒体内的表达水平;台盼蓝拒染法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布。结果:构建的融合基因经过DNA测序分析;构建的重组载体经限制性酶切分析及DNA测序分析证实为pCMV-Script/mito-MPG重组真核表达载体;转染pCMV-Script/mito-MPG载体组(MPG组)检测到mito-MPGmRNA的表达,转染pCMV-Script载体组(P组)及未转染组(C组)细胞内则未检测到;MPG组细胞线粒体内检测到MPG,P组及C组则未检测到;MPG组细胞增殖能力明显下降,P组及C组细胞增殖能力无明显差异,倍增时间分别为72.6h(C组)、73.5h(P组)、98.9h(MPG组);分裂增殖指数分别为51.3%(C组)、54.3%(P组)、26.1%(MPG组),MPG组出现亚二倍体峰。结论:成功构建了线粒体靶向人MPG基因表达载体,MPG在MnSOD线粒体靶向序列的引导下,顺利地进入了A549/DDP细胞线粒体内,并导致其增殖能力下降,部分细胞死亡。

As3MT、N6AMT1基因-环境交互作用对砷暴露所致皮肤损伤影响

目的探讨砷甲基转移酶(As3MT)和N-6-腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1(N6AMT1)基因多态性及基因-环境交互作用与砷暴露所致皮肤损伤(AISL)的关联性。方法于2010年9月到2011年12月在内蒙古五原县入选饮水型砷暴露人群335人,65例被确诊患有AISL。应用MassARRAY^(?)分子量阵列平台检测基因型,高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定尿砷代谢物,砷暴露时间由其高砷水饮用时间确定,多因子降维法与岭回归模型分析基因型、环境因素的单独效应及基因-环境的交互作用。结果 As3MT基因rs3740400位点CA/AA基因型、N6AMT1基因rs 1006903位点GC/CC基因型和尿二甲基胂酸(DMA)升高为AISL的独立危险因素(P<0.05)。rs3740400位点基因型-尿无机砷(iAs)-单甲基胂酸(MMA)的交互作用与AISL发生风险间存在显著的统计学关联(OR=0.62, 95%CI=0.41～0.94,P=0.024),模型的验证样本准确率为0.577 6,交叉验证一致性为9/10。结论 As3MT、N6AMT1基因多态性及尿砷化合物水平均与AISL独立相关,rs3740400位点基因型、尿iAs和MMA的交互作用在慢性砷中毒的发生发展中具有重要作用。